FGF1-FGF21嵌合蛋白及其治疗糖尿病的应用制造技术

本发明专利技术提供了FGF1‑FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突变体和FGF21的C尾，其减少促细胞分裂和增殖副作用，并且具有长效的降糖、降脂等活性。

FGF1-FGF21 chimeric protein and its application in the treatment of diabetes mellitus

The present invention provides a chimeric protein of FGF1_FGF21, which includes a mutant of FGF1 and a C tail of FGF21. The chimeric protein reduces the side effects of promoting cell division and proliferation, and has long-term hypoglycemic and lipid-lowering activities.

【技术实现步骤摘要】
FGF1-FGF21嵌合蛋白及其治疗糖尿病的应用
本专利技术属于蛋白质
，具体而言，本专利技术涉及长效FGF21的激动剂，其是FGF1-FGF21嵌合蛋白。另外本专利技术还涉及该蛋白的应用等，如治疗糖尿病的应用。
技术介绍
成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor，FGF)中共有18个家族成员，被分为5个旁分泌和1个内分泌亚家族。FGF作用的发挥则是通过与细胞表面具有酪氨酸激酶活性的FGF受体(FGFReceptor，FGFR)相互作用进而引起受体的二聚化并进一步激活下游级联信号来实现的。其中，成纤维细胞生长因子21(FGF21)是内分泌作用的FGF19亚家族的成员。由于FGF21在代谢和安全性方面的优点，它被寄予作为糖尿病、肥胖和脂肪代谢异常(dyslipidemia)的药物的厚望。然而它的体内药效和半衰期却不理想，因此现有技术对它的研究包括，将FGF21与Fc融合，定点突变FGF21上蛋白酶裂解位点，FGF21与靶向性抗体融合，PEG化。本专利技术人跳出了现有技术研究的框架，经过长期研究，令人意外地发现了一种长效FGF21的激动剂，其是FGF1-FGF21嵌合蛋白，但是并不包括FGF1-FGF21的全部部分，不但引入有限的突变，即可使得其仅能与FGFR形成较弱的二元复合物即可启动代谢调控的信号通路，而基本丧失了促细胞分裂和增殖的功能，同时，只使用了一小部分FGF21，又提供了长效的降糖等药理作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的FGF1-FGF21嵌合蛋白，其基本消除了促细胞分裂和增殖的能力，不但仍旧保留了FGF21的降血糖、降血脂等功能，而且可以长效地起效。另外，本专利技术还提供了该突变体的编码基因、表达载体和宿主细胞以及医药用途等。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了FGF1-FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突变体和FGF21的C尾，其中FGF1突变体的促细胞分裂和增殖的能力减少。本专利技术第一方面的嵌合蛋白减少(优选消除)促细胞分裂和增殖的能力，不但仍旧保留了FGF21的降血糖、降血脂等功能，而且可以长效地起效。优选本专利技术第一方面的嵌合蛋白由FGF1突变体和FGF21的C尾组成，更优选其从N端到C端由FGF1突变体和FGF21的C尾组成。优选在本专利技术第一方面的嵌合蛋白中，FGF1突变体具有Lys127、Lys128和/或Lys133突变，优选具有Lys127Asp、Lys128Gln和/或Lys133Val突变。在本文中，突变的表示采用本领域技术人员所熟知的方式。例如，Lys127表示对第127位上的Lys进行突变；而Lys128Gln表示对第128位上的Lys进行突变，突变为Gln。突变可以是添加、缺失和/或取代。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加和/或缺失了氨基酸残基的多肽或蛋白质，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》等本领域公知的文献中。在本专利技术的具体实施方式中，突变是取代。在本专利技术的具体实施方式中，该突变体(仅)具有Lys127Asp、Lys128Gln和Lysl33Val突变。优选在本专利技术第一方面的嵌合蛋白中，FGF21的C尾包括FGF21第142-182位。在本专利技术的具体实施方式中，本专利技术第一方面的嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。在第二方面，本专利技术提供了编码本专利技术第一方面的嵌合蛋白的多核苷酸。在本文中，多核苷酸可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得编码本专利技术的突变体的核酸分子多核苷酸或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸分子。在第三方面，本专利技术提供了一种载体，其含有本专利技术第二个方面所述的多核苷酸。在本文中，载体包括表达载体和克隆载体，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本专利技术中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在本专利技术的具体实施方式中，使用的是已经商品化的pET质粒。在第四方面，本专利技术提供了一种细胞，如宿主细胞，其含有本专利技术第二个方面所述的多核苷酸。本专利技术的细胞可以含有本专利技术第三方面的载体，也可以用本专利技术第二方面的多核苷酸转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本专利技术所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。优选本专利技术的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。在第五方面，本专利技术提供了药物组合物，其包含本专利技术第一方面的突变体以及药学上可接受的载体。本专利技术的药物组合物能治疗糖尿病、降血糖、治疗或预防肥，并且其减少(甚至消除)促细胞增殖的副作用，而且还能够长效地起效。在本文中，长效指的是具有比野生型FGF21更长体内半衰期。在本文中，药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如冻干剂、片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂或喷雾剂，更优选该药物组合物为注射剂型，如冻干粉针剂。也优选该药物组合物是液体制剂，如可以包含缓冲液(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)。在第六方面，本专利技术提供了本专利技术第一方面的嵌合蛋白在制备减少促细胞分裂和增殖副作用的长效FGF21药物中的应用。在本文中，FGF21药物指的是用语预防或治疗野生型FGF21可用于预防或治疗的疾病的药物。本专利技术的嵌合蛋白及其药物能够显著降低(甚至基本消除)这样的副作用，从而能够长期安全地给药。本专利技术的嵌合蛋白及其药物基本保留了的降糖的功能。因此，优选在本专利技术第六方面的应用中，药物用于降血糖。也优选在本专利技术第六方面的应用中，药物用于治疗糖尿病，尤其是2型糖尿病。本专利技术的嵌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.FGF1‑FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突变体和FGF21的C尾，其中FGF1突变体的促细胞分裂和增殖的能力减少，优选其由FGF1突变体和FGF21的C尾组成，更优选其从N端到C端由FGF1突变体和FGF21的C尾组成。

【技术特征摘要】
1.FGF1-FGF21嵌合蛋白，其包括FGF1突变体和FGF21的C尾，其中FGF1突变体的促细胞分裂和增殖的能力减少，优选其由FGF1突变体和FGF21的C尾组成，更优选其从N端到C端由FGF1突变体和FGF21的C尾组成。2.权利要求1所述的嵌合蛋白，其中，FGF1突变体具有Lys127、Lys128和/或Lys133突变，优选具有Lys127Asp、Lys128Gln和/或Lys133Val突变。3.权利要求1所述的嵌合蛋白，其中，FGF21的C尾包括FGF21第142-182位。4.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄志锋，牛建楼，赵龙伟，穆萨·穆罕默迪，
申请(专利权)人：黄志锋，温州木沙生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33