一种重组猪IL-29融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种重组猪IL‑29融合蛋白及其制备方法与应用，所述融合蛋白由猪IL‑29直接或间接通过连接元件与免疫球蛋白Fc片段或猪血清白蛋白（PSA）连接而成。所述猪IL‑29融合蛋白可基于基因工程技术，利用哺乳动物细胞表达系统制备得到。本发明专利技术提供的重组猪IL‑29融合蛋白与天然猪IL‑29相比，半衰期更长，抗病毒活性更高，可用于制备预防和治疗猪病毒性疾病的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种重组猪IL-29融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医药和动物病毒性疾病的防控
，具体地说，涉及一种重组猪IL-29融合蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
白介素29（IL-29）是2003年首次被报道的一种具有抗病毒活性的细胞因子，在氨基酸序列上与IL-10细胞因子家族高度相似；因具有干扰素类的抗病毒活性，故也属于Ⅲ型干扰素或IFN-λ家族，也称为IFN-λ1。IL-29，与IFN-α/β（Ⅰ型干扰素）类似，通过与相应的受体结合，激活JAK-STAT信号通路，诱导下游干扰素刺激基因(ISGs)的转录，从而刺激与抗病毒应答相关的蛋白表达，包括MxA、OASL和PKR等抗病毒蛋白。MxA是抗粘病毒蛋白家族成员，能够阻碍病毒核酸进入胞内。OASL是2’-5’寡聚腺苷酸合成酶家族成员，可以抑制病毒蛋白合成及病毒感染。PKR是双链RNA依赖性蛋白激酶，可引起细胞凋亡进而阻碍病毒的复制。体外研究显示人IL-29可以降低，包括巨细胞病毒（CMV）、乙型肝炎病毒（HBV）、脑心肌炎病毒（EMCV）、水泡性口炎病毒（VSV）在内的，病毒的复制和诱导的细胞病变效应。ZymoGeneticsInc.公司研制的聚乙二醇化的IFN-λ1(PEG-IL-29)是治疗丙型肝炎的一种干扰素新药，1期临床结果显示对HCV（丙型肝炎病毒）患者单次注射PEG--IL-29(2周1次,1.5µg/kg和3µg/kg)或与Ribavirin联合使用(PEG-IL-29每周1次，0.5、0.75和2.25µg/kg)，均表现出明显的抗病毒效果，并且人体对该药有良好的安全性和耐受性，无明显的临床不良反应。虽然IL-29与IFN-α/β具有相似的抗病毒活性，但由于IFN-α/β受体广泛分布于各种类型的细胞上，IFN-α/β与受体结合除了抗病毒外，还具有免疫调节、免疫抑制和抗细胞增殖的作用，因此，临床使用具有非常明显的副作用，包括流感样综合征、红细胞和白细胞减少、骨髓细胞减少以及精神异常（抑郁、妄想、焦虑等）等。IL-29的受体之一—IL-28R1仅特异性表达于特定组织，如角质形成细胞、支气管上皮细胞和肝细胞，受体的特异性决定细胞与IL-29结合的特异性，因此IL-29的临床副作用明显低于IFN-α/β。在现代规模化、集约化的养猪厂中，病毒性传染病的爆发，如蓝耳病、猪流行性腹泻、非洲猪瘟等，给猪场造成了重大的经济损失。猪IFN-α是已有的兽用干扰素，但是用于治疗病毒传染病时，因免疫抑制，引起猪发烧、体重降低等副作用，影响猪的能量转换因而限制使用，故常用于疫苗的免疫增强。研究表明，猪IL-29可有效抑制猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、水疱性口炎病毒（VSV）、伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）等病毒复制。并且在回肠类器官上，IL-29比IFN-α更有效的诱导ISGs表达和抑制PEDV感染。此外，猪IL-29可以用于猪病毒性传染病的治疗，不会影响猪的饮食、能量转换等，副作用明显低于猪IFN-α。猪天然干扰素类细胞因子在体内半衰期短，一般为2~4个小时，用于猪的抗病毒防治需要每天注射1~2次。此外商品化的猪IFN-α是利用鸡新城病毒（NDV）诱导猪白细胞生产的，产量不足，质量参差不齐。用大肠杆菌系统生产干扰素蛋白已获成功，但细菌属于原核系统，不能正确加工折叠异源蛋白，且常以包涵体形式出现，增加了操作的难度。鉴于目前猪养殖中缺乏长效、安全的抗病毒干扰素类产品，本专利着眼于使用基因重组技术和哺乳动物蛋白表达技术，开发长效的猪IL-29融合蛋白，用于猪病毒性疾病的预防和治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的重组猪IL-29融合蛋白及其制备方法与应用。本专利技术的构思如下：利用基因工程技术将猪IL-29与Fc或猪白蛋白（PSA）融合产生新型重组蛋白pIL-29-Fc、pIL-29-PSA，不仅保留pIL-29的高生物活性，还可以获得较长的半衰期、更高的抗病毒活性；同时得到高纯度、可规模化生产的重组蛋白。使用哺乳动物表达体系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达重组蛋白，能获得在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然的蛋白分子。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供重组猪IL-29融合蛋白为pIL-29Fc、pIL-29PSA，所述融合蛋白是由猪IL-29直接或间接通过连接元件与融合伴侣连接而成.所述的融合伴侣，包括免疫球蛋白、白蛋白等。其中，免疫球蛋白的Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区；优选哺乳动物的免疫球蛋白，包括人或犬、猫、猪、鼠、马、牛等哺乳动物，更优选猪IgG2a免疫球蛋白的Fc片段。其中，血清白蛋白优选哺乳动物的血清白蛋白，包括人或犬、猫、猪、鼠、马、牛等哺乳动物，更优选猪血清白蛋白（PSA）。所述融合蛋白由猪IL-29与融合伴侣直接或间接通过Linker连接而成。其中，所述Linker是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala、Thr中的至少一种；优选地，所述Linker为（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n，其中n为2-5之间的整数，更优选n为3。新型的重组猪pIL-29融合蛋白pIL-29-Fc为；（a）由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（b）与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性且具有相同功能的由（a）衍生的蛋白质。新型的重组猪pIL-29融合蛋白pIL-29-PSA为；（c）由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（d）与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有90%以上同源性且具有相同功能的由（c）衍生的蛋白质。本专利技术还提供表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系等生物材料，其包括包含编码上述融合蛋白的核苷酸。本专利技术提供所述一种重组猪IL-29融合蛋白的制备方法，所述方法包括：分别人工合成pIL-29-Fc、pIL-29-PSA融合蛋白的编码基因，并进行密码子优化，将优化后的基因分别构建到真核表达载体中，转入真核细胞，并在真核细胞中表达，分离纯化目标蛋白。所述真核表达载体包括但不限于pcDNA3.1，所述真核细胞包括但不限于293、CHO细胞。本专利技术还提供上述两种重组猪IL-29融合蛋白在制备用于预防和治疗家畜病毒感染疾病的药物或组合药物中的应用。其中，所述动物包括但不限于猪、牛、羊等；优选猪。本专利技术提供所述一种重组猪IL-29融合蛋白的以下任一应用：1）用于猪抗病毒感染的防治，包括预防病毒感染或感染后的病毒清除；2）用于制备猪抗病毒药物或组合物。本专利技术提供一种猪抗病毒药物或组合物，有效成分为上述重组猪IL-29融合蛋白的任一种。所述病毒包括但不限于猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒、水疱性口炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒等。经过修饰的蛋白，包括融合蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组猪IL-29融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是由猪IL-29直接或间接通过连接元件与融合伴侣连接而成。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组猪IL-29融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是由猪IL-29直接或间接通过连接元件与融合伴侣连接而成。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白为pIL-29-Fc，其特征在于，所述的融合伴侣为免疫球蛋白的Fc片段，包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区，优选哺乳动物的免疫球蛋白，包括人或犬、猫、猪、鼠、马、牛等哺乳动物，更优选猪IgG2a免疫球蛋白的Fc片段；
融合蛋白pIL-29-Fc为：
（a）由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
（b）与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有90%以上同源性且具有相同功能的由（a）衍生的蛋白质。


3.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白为pIL-29-PSA，其特征在于，所述的融合伴侣为血清白蛋白，优选哺乳动物的血清白蛋白，包括人或犬、猫、猪、鼠、马、牛等哺乳动物，更优选猪血清白蛋白（PSA）；
融合蛋白pIL-29-PSA为：
（c）由SEQIDNO:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
（d）与SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有90%以上同源性且具有相同功能的由（c）衍生的蛋白质。


4.根据权利要求1-3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由猪IL-29与融合伴侣直接或间接通过Linker连接而成；所述Linker是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，师磊，钟小荣，于金库，韩国，熊剑胜，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11