一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种IL7‑Fc‑GMCSF融合蛋白及其应用，所述融合蛋白为二聚体蛋白，包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过IL7和GMCSF刺激外周血淋巴细胞增殖的作用进行外周血淋巴细胞的体外培养。

【技术实现步骤摘要】
一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及其应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及其应用。
技术介绍
IL7(interleukin7,白介素7)是白介素家族成员之一，为多潜能的细胞因子，主要由胸腺基质细胞产生，具有广泛的免疫效应，在T细胞生长、存活及分化中具有重要作用。IL7的主要功能是促进B细胞和T细胞生长及抗凋亡作用，是B细胞生长和preB细胞生存、分化、增殖因子。在T细胞发育、增殖及稳态调节中起关键作用。其效应细胞主要为CD8+亚群。IL7支持记忆CD8+T细胞稳态扩展和生存还可刺激外周血单核细胞的裂解活性。提高机体的免疫能力对于DC和NK细胞的产生有促进作用。粒细胞-巨噬细胞集落因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF)是一种细胞因子，可促进造血祖细胞分化为粒细胞、巨噬细胞，并且可以通过调节抗原递呈细胞(antigenpresentingcells,APCs)尤其是树突状细胞的数量和功能来增强机体的免疫应答。GMCSF可通过增强特异性抗体应答和促进T细胞增殖增强机体的免疫反应。rhGM-CSF的生理作用十分广泛，一方面为刺激骨髓的造血功能，刺激粒细胞、树突细胞、单核细胞、T细胞的增殖，并能促进单核细胞和粒细胞的成熟另一方面促进单核巨噬细胞与中性粒细胞释放大量的细胞因子参与机体的免疫调节，促进中性粒细胞的粘附因子的表达。因此，rhGM-CSF可通过刺激DC细胞的增殖，增强其抗原提呈功能，促进其与淋巴细胞结合，促进淋巴细胞的增殖及分化，进而促进免疫应答的发生；同时，可直接刺激T细胞的增殖，促进免疫应答的发生。抗体的Fc端，具有高稳定性，长效性，能够有效保证融合蛋白的活性同时增加融合蛋白的效用。目前尚未见IL7-Fc-GMCSF融合蛋白及利用Knob-in-hole方式进行表达IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的相关报道。
技术实现思路
为此，本专利技术了提供一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白和应用。本专利技术采取的具体技术方案是：本专利技术的第一方面提供了一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，所述融合蛋白为二聚体蛋白，包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述融合蛋白由Fc蛋白片段分别与IL7蛋白片段、GMCSF蛋白片段通过Knob-in-hole方式融合连接。IL7蛋白片段来自人的IL7区域；Fc蛋白片段来自人IgG的Fc蛋白片段；GMCSF蛋白片段来自人GMCSF的GMCSF区域。本专利技术的第二方面是提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本专利技术的第三方面是提供了一种含有IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的表达载体，在表达载体中插入IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，表达载体优选pCDNA3.4载体。本专利技术的第三方面是提供了上述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)对pCDNA3.4载体进行处理：用NotI/XbaI酶切(2)构建IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白基因片段，以全基因合成的分段引物作为模板进行PCR扩增，回收PCR产物,克隆至处理后的pCDNA3.4载体NotI/XbaI酶切位点，得含有IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白的表达载体；(3)将含有IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白的表达载体转化至宿主菌中进行扩大培养，得低内毒素质粒；(4)细胞培养：采用HEK293细胞，依次进行细胞复苏、细胞初次传代、细胞再次传代培养，得细胞液；(5)瞬时转染与表达：用培养液稀释低内毒素质粒IL7-Fc-Flag和质粒GMCSF-Fc-His，混匀得溶液一；用培养液稀释转染试剂，混匀得溶液二；将溶液二加入溶液一中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养；(6)培养表达一周，收集上清，8000rpm离心5min；分离提纯所表达的融合蛋白。优选地，质粒宿主菌选自TOP10。优选地，分离提纯所表达的融合蛋白的方法为上Ni亲和层析柱纯化和Flag填料纯化，去除同源二聚体，得到IL7-Fc-GMCSF的异源二聚体结构。本专利技术的第四方面是提供了上述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白在制备治疗用免疫细胞培养的药物中的应用。所述免疫细胞优选为外周血淋巴细胞。本专利技术的第五方面是提供了一种外周血淋巴细胞培养试剂，包含权利要求1所述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白。有益效果：本专利技术构建了人IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，通过IL7和GMCSF刺激外周血淋巴细胞增殖的作用进行外周血淋巴细胞的体外培养。附图说明图1显示为目标克隆PCR片段；图2显示为重组质粒阳性PCR鉴定；泳道M：DL5000DNAMarker，泳道1-2：重组质粒PCR。图3显示为融合蛋白SDS-PAGE检测图；泳道1：还原样品(Reducing)泳道2：非还原样品(Non-Reducing)泳道M：ProteinMarker(Fermentas,SM0661)图4显示为融合蛋白SEC-HPLC检测图；图5显示为IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的异二聚化形式。具体实施方式为详细说明技术方案的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。基因的合成：将同一个Fc蛋白片段分别与IL7蛋白片段、GMCSF蛋白片段通过Knob-in-hole方式融合连接，获得二聚体(如图5所示),即IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，其中，IL7蛋白片段来自人的IL7区域；Fc蛋白片段来自人IgG的Fc蛋白片段；GMCSF蛋白片段来自人GMCSF的GMCSF区域。所述融合蛋白包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。SEQIDNO.1:HumanIL7-(G4S)3-Fc(Knob)-Flag–AvitagMHSSALLCCLVLLTGVRADCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEHGGGGSGGGGSGGGGSEPKSADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为二聚体蛋白，包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种IL7-Fc-GMCSF融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为二聚体蛋白，包括二聚化的第一条多肽链和第二条多肽链，第一条多肽链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，第二条多肽链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由Fc蛋白片段分别与IL7蛋白片段、GMCSF蛋白片段通过Knob-in-hole方式融合连接。


3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，IL7蛋白片段来自人的IL7区域；Fc蛋白片段来自人IgG的Fc蛋白片段；GMCSF蛋白片段来自人GMCSF的GMCSF区域。


4.编码权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。


5.一种含有IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的表达载体，其特征在于，在表达载体中插入IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白，表达载体优选pCDNA3.4载体。


6.权利要求1所述IL7-Fc-GMCSF融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对pCDNA3.4载体进行处理：用NotI/XbaI酶切
(2)构建IL7-Fc-Flag和GMCSF-Fc-His融合蛋白基因片段，以全基因合成的分段引物作为模板进行PCR扩增，回收PCR产物,克隆至处理后的pCDNA3.4载体No...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑飞剑，吴丽萍，查长春，唐静秋，朱锦秀，张婧，
申请(专利权)人：泰州市百英生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32