一种抗PD-1的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗PD

【技术实现步骤摘要】
一种抗PD
‑
1的纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种抗PD
‑
1纳米抗体及应用，属于生物

技术背景
[0002]程序性死亡受体
‑
1(programmed cell death
‑
1，PD
‑
1)及其配体(programmed death
‑
1 ligand，PD
‑
L1)分子是肿瘤免疫逃逸及免疫耐受过程中的关键性因素。靶向于PD
‑
1/PD
‑
L1通路的免疫治疗虽然获得了巨大成功，但目前尚未找到确切的疗效预测指标，筛选出最获益的治疗群体。PD
‑
1存在膜性和可溶性(sPD
‑
1)两种形式，由于可溶形式存在的分子，使PD
‑
1/PD
‑
L1通路无论是在组成还是功能方面都更加的复杂多变，因此动态监测血液中sPD
‑
1的变化过程可能会帮助我们更准确的判断患者的免疫状态及预测疗效，筛选最佳治疗人群。
[0003]纳米抗体是在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术研发得到的，其分子量约为15KD，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子。最初有比利时科学家Hamers.R在骆驼血液中发现，普通的抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现的新型抗体只有两条重链，没有轻链，这些新型抗体能像正常抗体一样于抗原紧密结合，但不像单链抗体那样相互粘连聚集成块。与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。因此，应用纳米抗体技术监测血液中sPD
‑
1的变化过程具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的是：提供一种抗PD
‑
1的纳米抗体，能特异性识别PD
‑
1。同时，还提供该抗体的应用。
[0005]本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：
[0006]一种抗PD
‑
1的羊驼单重链纳米抗体，所述抗体至少具有以下技术特征之一：
[0007]i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基；
[0008]ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第51—60位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第51—58位氨基酸残基；
[0009]iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第99—117位氨基酸残基，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第97—116位氨基酸残基。
[0010]优选地，所述抗PD
‑
1的羊驼单重链纳米抗体包括重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3；重链CDR1即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基；重链CDR2即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第51—60位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第51—58位氨基酸残基；重链CDR3即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第99—117位氨基酸残基，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第97—116位氨基酸残基。
[0011]优选地，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
[0012]本专利技术还提供：
[0013]编码前文所述抗PD
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1的纳米抗体的核酸。
[0014]优选地，所述核酸的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
[0015]本专利技术还提供：
[0016]具有前文所述的核酸的原核表达载体和哺乳系统表达载体。
[0017]优选地，原核表达载体为pET28a，哺乳系统表达载体为pcDNA3.1。
[0018]本专利技术还提供：
[0019]具有前文所述两种表达载体的宿主细胞。
[0020]优选地，原核表达宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，哺乳系统表达宿主细胞为CHO。
[0021]本专利技术还提供：
[0022]前文所述抗PD
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1纳米抗体在检测人体外周血中可溶性PD
‑
1的应用。
[0023]本专利技术通过噬菌体展示技术获得了靶向PD
‑
1的纳米抗体，该抗体能够以高亲和力特异性识别PD
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1。该抗体能够检测人体外周血中可溶性的PD
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1，具有重要的应用价值。
附图说明
[0024]图1为实施例1中ELISA检测每轮淘选富集噬菌体对PD
‑
1的结合情况图。
[0025]图2为实施例1中ELISA检测单克隆噬菌体对抗原蛋白的结合情况图。
[0026]图3为实施例1的单克隆富集率分析图。
[0027]图4为实施例2的原核表达载体和哺乳系统表达载体示意图。
[0028]图5为实施例2的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的电泳检测图。
[0029]1：Unique6哺乳系统表达抗体
[0030]2：Unique11哺乳系统表达抗体
[0031]3：Unique6原核表达抗体
[0032]4：Unique11原核表达抗体
[0033]图6为实施例3的原核表达和哺乳系统表达的纳米抗体的结合ELISA结果图。
[0034]图7为实施例4的双抗夹心法绘制的Human PD
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1的标准曲线。
[0035]图8为实施例4的20例正常人外周血中可溶性PD
‑
1的含量。
具体实施方式
[0036]下面结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。但是本专利技术不限于所给出的例子。所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂和材料如无特别说明均为市售品。
[0037]实施例1、筛选抗PD
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1纳米抗体
[0038]以Human PD
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1/His为抗原，应用噬菌体展示技术从羊驼天然纳米抗体噬菌体文库(文库大小为1.47x109)中筛淘抗PD
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1的纳米抗体。
[0039]采用固相淘选的方法，将100ug/mL PD
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1/His包被到ELISA板条上，每孔100uL，4℃过夜包被。PBST洗三遍，每孔加入200uL 3％的酪蛋白，37℃封闭2小时。PBST洗三遍后加入噬菌体展示库(约有1x10
12
CFU)，37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，PBST洗10遍。每孔加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗PD
‑
1的羊驼单重链纳米抗体，其特征是，所述抗体至少具有以下技术特征之一：i、所述重链包括重链CDR1，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第26—35位氨基酸残基；ii、所述重链包括重链CDR2，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第51—60位氨基酸残基，或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第51—58位氨基酸残基；iii、所述重链包括重链CDR3，即SEQ ID NO:3所示氨基酸序列中的第99—117位氨基酸残基，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列中的第97—116位氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的抗PD
‑
1的纳米抗体，其特征是，所述抗PD
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1的羊驼单重链纳米抗体包括所述的重链CDR1、重链CDR2以及重链CDR3。3.根据权利要求2所述的抗PD
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉芳，叶军，郑飞剑，吴丽萍，刘郧飞，查长春，
申请(专利权)人：泰州市百英生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：