靶向Claudin18.2的CAR分子、其修饰的免疫细胞及用途制造技术

本发明专利技术公开了一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如式car‑[(IRES)‑f]

【技术实现步骤摘要】
靶向Claudin18.2的CAR分子、其修饰的免疫细胞及用途
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种靶向Claudin18.2的CAR分子、其修饰的免疫细胞及用途。
技术介绍
细胞治疗是一种新兴的、具有显著疗效的疾病治疗模式。本领域技术人员一直致力于开发新的细胞免疫疗法，以提高细胞免疫疗法的效果，并降低其副作用。嵌合抗原受体T细胞(简称CART或CAR-T)是从患者体内分离出T细胞，在体外利用嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，然后再将改造后的CART细胞扩增、回输至患者体内，达到治疗肿瘤的效果。嵌合抗原受体NK细胞(简称CARNK或CAR-NK)是从患者体内分离出NK细胞，在体外利用CAR修饰NK细胞，使其能够特异性识别癌细胞，然后再将改造后的CARNK细胞扩增、回输至患者体内，达到治疗肿瘤的效果。胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CART细胞，可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应。随后发展的第二代CART细胞加入了CD28或4-1BB(又称CD137)的胞内信号区，胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/4-1BB共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CART在体内的存活周期和抗肿瘤效果。近些年发展的第三代CART细胞，其进一步提高了CART在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。细胞连接密蛋白(Claudin或CLDN)在人、鼠等物种都有表达，是细胞间层密封关联蛋白，在控制对细胞层间离子流、维持细胞极性和细胞间信号转递具有重要作用。Claudin18.2是临床证明有效的肿瘤治疗药物开发靶点，目前已有多篇针对Claudin18.2的抗体专利，例如WO2014146672A1以及CN201810610790.3，但还没有药物上市。CN201410341504.X公开了一种及靶向CLD18A2(即Claudin18.2)的T淋巴细胞及其制备方法和应用，也有临床数据报道，但是CART药效和安全性还有很大的提升空间。
技术实现思路
为解决现有技术中靶向Claudin18.2的免疫细胞效果不佳的问题，提供一种靶向Claudin18.2的CAR分子、其修饰的免疫细胞及用途。设计CAR时，针对特定抗原的抗体基因是一种关键性的选择，鉴于体内基因表达的复杂性以及各种不可控因素，选择到一个合适的用于CAR的基因是非常困难的。并且，很多肿瘤特异性的抗原，很难找到针对其的且适合于构建CAR细胞的特异性分子，在建立CAR后，往往无法获得有活性的胞外结合区，这也是发展CAR技术的难点。此外，尽管CAR细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但亦需要考虑其较高的风险。比如，由于某些正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。现有技术中，靶向Claudin18.2抗体特异性结合Claudin18.2的效果不佳，靶向Claudin18.2的CAR细胞的效果也不够优异，而众所周知的是，开发出兼具有效性和安全性的靶向Claudin18.2的CAR细胞难度极大。专利技术人通过实验意外地发现，本专利技术CAR中的抗体结合活性/亲和力高，意味着在同样的工艺(同病毒滴度，转染效率)下，本专利技术的CAR能更好地结合到靶细胞，特异性更好，减少非靶细胞结合所产生的副作用。使用本专利技术的CAR，即使很少的剂量就可以发挥作用，有极高的应用价值。本专利技术中针对CLDN18.2的CAR细胞的抗原结合部分(抗体)是人源化的序列，可以减少CAR治疗产生免疫原性风险。通过新一代CAR设计，具体地是在CAR的C末端引入能有效杀伤肿瘤的细胞因子、细胞因子和其受体结合复合物等，并使得这些因子和/或复合物能够分泌胞外、肿瘤细胞区域达到更好的抑制肿瘤的效果。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之一为：提供一种核酸构建体，所述核酸构建体具有如式car-[(IRES)-f]m所示的结构，其中，IRES为内部核糖体进入位点序列；f编码功能性蛋白F，m为0或非0自然数；car编码CAR且所述CAR包括：(a)特异性识别CLDN18.2的胞外结合结构域scFv；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)共刺激胞内结构域；(e)信号传导结构域；其中，所述胞外结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含至少1个选自以下的互补决定区(CDR)：如SEQIDNO:11或SEQIDNO:12氨基酸序列或其突变所示的CDR1；如SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2；如SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；所述重链可变区包含至少1个选自以下的CDR：如SEQIDNO:15氨基酸序列或其突变所示的CDR1；如SEQIDNO:16氨基酸序列或其突变所示的CDR2；如SEQIDNO:17氨基酸序列或其突变所示的CDR3；所述突变保持或改善了所述抗体或抗原结合片段与所述CLDN18.2抗原的结合。在本专利技术中，“-”可以为化学键例如肽键、糖苷键，或连接子例如(GGGGS)[本文中简称(G4S)n]；也可以仅为划分不同基团、结构域、群组(包括核苷酸或氨基酸)的一种人为手段，在此情况下，所述不同基团、结构域、核苷酸群或氨基酸群间实际上不存在额外的化学键。上述的特异性识别CLDN18.2的胞外结合结构域除了为单链可变片段(scFv)外，还可以为Fab或单结构域抗体(sdFv)。在一较佳的实施例中，所述scFv的结构为轻链可变区(VL)-连接子(Linker)-重链可变区(VH)或VH-Linker-VL，-为化学键，所述Linker优选(G4S)n；所述n优选1至6的整数，更优选3和4。在一较佳的实施例中，所述轻链可变区包含如SEQIDNO:11氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；或，如SEQIDNO:12氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；和/或，所述重链可变区包含如SEQIDNO:15氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:16氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:17氨基酸序列或其突变所示的CDR3。较佳地，所述轻链可变区包含如SEQIDNO:11氨基酸序列或其突变所示的CDR1、SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2和SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；且，所述重链可变区包含如SEQIDNO:15氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:16氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:17氨基酸序列或其突变所示的CDR3；或，所述轻链可变区包含如SEQIDNO:12所示的氨基酸序列或其突变的CDR1、如SEQIDNO:13所示的氨基酸序列或其突本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如式car-[(IRES)-f]

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如式car-[(IRES)-f]m所示的结构，其中，IRES为内部核糖体进入位点序列；f编码功能性蛋白F，m为0或非0自然数；car编码CAR且所述CAR包括：(a)特异性识别CLDN18.2的胞外结合结构域scFv；(b)铰链结构域；(c)跨膜结构域；(d)共刺激胞内结构域；(e)信号传导结构域；
其中，所述胞外结合结构域包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含至少1个选自以下的互补决定区(CDR)：如SEQIDNO:11或SEQIDNO:12氨基酸序列或其突变所示的CDR1；如SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2；如SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；所述重链可变区包含至少1个选自以下的CDR：如SEQIDNO:15氨基酸序列或其突变所示的CDR1；如SEQIDNO:16氨基酸序列或其突变所示的CDR2；如SEQIDNO:17氨基酸序列或其突变所示的CDR3；所述突变保持或改善了所述抗体或抗原结合片段与所述CLDN18.2抗原的结合。


2.如权利要求1所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体中，所述scFv的结构为轻链可变区-连接子-重链可变区或重链可变区-连接子-轻链可变区，所述连接子优选(GGGGS)n；n优选1至6的整数，更优选3和4。


3.如权利要求1或2所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体中，所述轻链可变区包含如SEQIDNO:11氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；或，如SEQIDNO:12氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；
和/或，所述重链可变区包含如SEQIDNO:15氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:16氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:17氨基酸序列或其突变所示的CDR3；
较佳地，所述轻链可变区包含如SEQIDNO:11氨基酸序列或其突变所示的CDR1、SEQIDNO:13氨基酸序列或其突变所示的CDR2和SEQIDNO:14氨基酸序列或其突变所示的CDR3；且，所述重链可变区包含如SEQIDNO:15氨基酸序列或其突变所示的CDR1、如SEQIDNO:16氨基酸序列或其突变所示的CDR2，和，如SEQIDNO:17氨基酸序列或其突变所示的CDR3；或，
所述轻链可变区包含如SEQIDNO:12所示的氨基酸序列或其突变的CDR1、如SEQIDNO:13所示的氨基酸序列或其突变的CDR2，和，如SEQIDNO:14所示的氨基酸序列或其突变的CDR3；且，所述重链可变区包含如SEQIDNO:15所示的氨基酸序列或其突变的CDR1、如SEQIDNO:16所示的氨基酸序列或其突变的CDR2，和，如SEQIDNO:17所示的氨基酸序列或其突变的CDR3。


4.如权利要求1-3任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体中，所述胞外结合结构域包含如SEQIDNO:29-33中任一个氨基酸序列或其突变序列所示的轻链可变区；和/或，如SEQIDNO:34-37中任一个氨基酸序列或其突变序列所示的重链可变区；
优选地，所述胞外结合结构域包含如SEQIDNO:29的氨基酸序列所示的轻链可变区，如SEQIDNO:34的氨基酸序列所示的重链可变区；或，如SEQIDNO:31的氨基酸序列所示的轻链可变区，如SEQIDNO:34的氨基酸序列所示的重链可变区；如SEQIDNO:7的氨基酸序列所示的轻链可变区，如SEQIDNO:8的氨基酸序列所示的重链可变区。


5.如权利要求1-4任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体中，
(1)所述铰链结构域选自一种或多种以下分子的铰链区：CD8α、CD28、CD152、PD1和IgG1重链；
(2)所述跨膜结构域选自一种或多种以下分子的跨膜区：TCR的α、β、ζ链，CD3ε、CD3ζ，CD4，CD5，CD8α，CD9，CD16，CD22，CD27，CD28，CD33，CD37，CD45，CD64，CD80，CD86，CD134，4-1BB，CD152，CD154和PD1；
(3)所述共刺激胞内结构域选自一种或多种以下分子的胞内区：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、OX40、CD134、4-1BB、CD150、CD152、CD223、CD270、PD-L2、PD-L1、CD278、DAP10、NKD2CSLP76、TRIM、FcεRIγ和MyD88，优选CD28胞内区和/或4-1BB胞内区；和/或，
(4)所述信号传导结构域选自一种或多种以下分子的胞内区：Igα、Igβ，TCRξ，FcR1γ、FcR1β，CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD2，CD5，CD22，CD28，CD79a、CD79b，CD278，CD66d和CD3ζ；优选CD3ζ胞内区。


6.如权利要求1-5任一项所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体中，所述铰链结构域为CD8α铰链区，所述跨膜结构域为CD8α跨膜区，所述共刺激胞内结构域为CD28胞内区和/或4-1BB胞内区，所述信号传导结构域为CD3ζ胞内区；
优选地，所述CD8α铰链区为人CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQIDNO:27所示；所述CD8α...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳建，
申请(专利权)人：上海健信生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31