靶向CLDN18.2的抗体、双特异性抗体、ADC和CAR及其应用制造技术

提供了一种靶向CLDN18.2的抗体，其包含VL和/或VH，所述VL包含以下的CDR序列：如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的VL CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:13所示的VL CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:14所示的VL CDR3氨基酸序列；所述VH包含以下的CDR序列：如SEQ ID NO:15所示的VH CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:16所示的VH CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:17所示的VH CDR3氨基酸序列。还公开了一种靶向CLDN18.2的双特异性抗体、上述抗体的偶联体、靶向CLDN18.2的CAR分子及含其的细胞，以及他们的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向CLDN18.2的抗体、双特异性抗体、ADC和CAR及其应用本申请要求申请日为2018年6月17日的中国专利申请CN201810610790.3、2018年11月01日的中国专利申请CN201811295845.2、2019年02月03日的中国专利申请CN201910108951.3、2019年04月08日的中国专利申请CN201910276473.7的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种靶向CLDN18.2的抗体、双特异性抗体、ADC和CAR及其应用。
技术介绍
癌症是人类健康的巨大威胁，也是疾病领域导致死亡的重要原因之一。癌症治疗经历手术、化疗、靶向药物、肿瘤免疫治疗、联合治疗等各阶段的发展后，近年已经取得了巨大成就。在众多的癌症患者中，肺癌、胃癌、胰腺癌、食道癌和卵巢癌等癌症患者的治疗手段仍然高度未满足。针对这些肿瘤的治疗手段，包括大分子靶向药物如新的单克隆抗体，以及这些单克隆抗体和已有的肿瘤免疫治疗手段，如与免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1抗体联合治疗，为巨大的未满足的临床治疗的需求提供了新的可能和选择。细胞连接密蛋白(密蛋白，Claudin或CLDN)在人、鼠等物种中都有表达，是细胞间层密封关联蛋白，在控制对细胞层间离子流、维持细胞极性和细胞间信号转递具有重要作用。CLDN家族蛋白已经发现的有29种之多，CLDN18就是其中之一。CLDN18有两个同源分子，分别称为密蛋白18.1(CLDN18.1)和密蛋白18.2(CLDN18.2)。人密蛋白18.1(hCLDN18.1)和人密蛋白18.2(hCLDN18.2)高度同源，氨基酸同源性高达92％。hCLDN18.2在正常组织表达非常有限，仅见于胃黏膜分化上皮细胞，但在胃癌包括转移胃癌组织有特别的高表达(SahinU.etal.Claudin-18splicevariant2isapan-cancertargetsuitablefortherapeuticantibodydelveopment.ClinCancerRes.2008；14(23):7642-34)。进一步发现，CLDN18.2在不同癌症，包括大约70％的胃癌、50％的胰腺癌、30％的食道癌、25％的肺癌和卵巢癌等的患者组织都有表达。因此，CLDN18.2早已经成为理想的肿瘤患者标记物和抗肿瘤药物开发靶点，特别是靶向CLDN18.2的抗体开发用于肿瘤治疗，但因为靶点的特殊性，开发针对CLDN18.2治疗性抗体非常困难。人CLDN18.2蛋白全长261个氨基酸，见NCBI公开序列NP_001002026.1claudin-18isoform2，其中1-23为信号肽。CLDN18.2蛋白是一个跨膜蛋白，有两个膜外区域分别为信号肽后面大约55个氨基酸的胞外区1(Extracellularloop1，ECL1)和23个氨基酸ECL2。这一结构和人CLDN18.1非常相似，而且人CLDN18.2和人CLDN18.1的ECL2区域则完全相同。因而针对人CLDN18.2蛋白靶点抗体的开发，需要寻找针对人CLDN18.2蛋白的ECL1区域或空间结构的抗体。这使得这方面的工作变得更加困难。此外，针对人CLDN18.2膜蛋白的抗体发挥其功效至少包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长，通过和病人免疫细胞的效应作用，包括抗体依赖细胞毒性(ADCC)，和补体依赖细胞毒性(CDC)效应细胞介导的杀伤肿瘤细胞作用。而要寻找这样功能的抗体会更加困难。目前针对人CLDN18.2抗体研究只有IMAB362抗体(参见WO2014/146672)在临床试验阶段。IMAB362是针对人CLDN18.2的抗体，是人、鼠源嵌合抗体，存在免疫原性风险，亲和力不很高。细胞学实验证明其无内吞活性，不适合做ADC开发，且治疗效果极为有限，这在本专利技术的肿瘤模型药效评价中也得到了验证。此外，针对CLDN18.2靶点还没有进入临床或前期研发的双特异抗体。针对CLDN18.2靶点目前还没有在临床上开发的抗体药物偶联体(antibodydrugconjugates，ADC)药物。嵌合抗原受体(CAR)T细胞(简称CART或CAR-T)是从患者体内分离出T细胞，在体外利用CAR改造修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，将改造后的CART细胞扩增、回输至患者体内，达到治疗肿瘤的效果。CN201410341504.X公开了一种及靶向CLD18A2(即Claudin18.2)的T淋巴细胞及其制备方法和应用，也有临床数据报道，但是CART药效和安全性还有很大的提升空间。因此，本领域缺乏有效的靶向人CLDN18.2蛋白的抗体特别是人源化的抗体，以及细胞活性、PK活性和动物药效等更好的抗体、双特异性抗体、抗体药物偶联体(ADC)药物，以及更加有效的嵌合抗原受体(CAR)及含其的细胞。
技术实现思路
为克服本领域缺乏靶向CLDN18.2的抗体、双特异抗体、抗体药物偶联体和CAR分子的缺陷的技术问题，提供了一种靶向CLDN18.2的抗体、人源化抗体、双特异性抗体及其抗体药物偶联体、CAR分子及其制备方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术第一方面的技术方案为：一种靶向CLDN18.2的抗体，其包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述VL包含以下的互补决定区(CDR)序列：如SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示的VLCDR1氨基酸序列；如SEQIDNO:13所示的VLCDR2氨基酸序列；如SEQIDNO:14所示的VLCDR3氨基酸序列；所述VH包含以下的CDR序列：如SEQIDNO:15所示的VHCDR1氨基酸序列；如SEQIDNO:16所示的VHCDR2氨基酸序列；如SEQIDNO:17所示的VHCDR3氨基酸序列。所述靶向CLDN18.2的抗体和人、鼠CLDN18.2特异结合活性更好，Emax更高；亲和力(KinExA)高(优选达到了10pM级)；人血细胞中CDC活性更好；诱导CLDN18.2+细胞凋亡活性更好，抑制肿瘤细胞生长活性更好，动物药效更优，且体内药物代谢(PK)好，特别是更长的T1/2。其和鼠CLDN18.2有更好的结合活性。在一优选的实施例中，如上所述的靶向CLDN18.2的抗体，所述VL包含如SEQIDNO:11所示的VLCDR1、SEQIDNO:13所示的VLCDR2和SEQIDNO:14所示的VLCDR3的氨基酸序列；所述VH包含如SEQIDNO:15所示的VHCDR1、SEQIDNO:16所示的VHCDR2和SEQIDNO:17所示的VHCDR3的氨基酸序列；或，所述VL包含如SEQIDNO:12所示的VLCDR1、SEQIDNO:13所示的VLCDR2和SEQIDNO:14所示的VLCDR3的氨基酸序列；所述VH包含如SEQIDNO:15所示的VHCDR1、SEQIDNO:16所示的VHCDR2和SEQIDNO:17所示的VHCDR3的氨基酸序列。在本专利技术一个优选的实施方案中，提供一种如上所述靶向CLDN18.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，其包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述VL包含以下的互补决定区(CDR)序列：/n如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的VL CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:13所示的VL CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:14所示的VL CDR3氨基酸序列；/n所述VH包含以下的CDR序列：/n如SEQ ID NO:15所示的VH CDR1氨基酸序列；如SEQ ID NO:16所示的VH CDR2氨基酸序列；如SEQ ID NO:17所示的VH CDR3氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180617 CN 2018106107903;20181101 CN 201811295845一种靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，其包含轻链可变区(VL)和/或重链可变区(VH)，所述VL包含以下的互补决定区(CDR)序列：
如SEQIDNO:11或SEQIDNO:12所示的VLCDR1氨基酸序列；如SEQIDNO:13所示的VLCDR2氨基酸序列；如SEQIDNO:14所示的VLCDR3氨基酸序列；
所述VH包含以下的CDR序列：
如SEQIDNO:15所示的VHCDR1氨基酸序列；如SEQIDNO:16所示的VHCDR2氨基酸序列；如SEQIDNO:17所示的VHCDR3氨基酸序列。


如权利要求1所述的靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，所述VL包含如SEQIDNO:11所示的VLCDR1、SEQIDNO:13所示的VLCDR2和SEQIDNO:14所示的VLCDR3的氨基酸序列；所述VH包含如SEQIDNO:15所示的VHCDR1、SEQIDNO:16所示的VHCDR2和SEQIDNO:17所示的VHCDR3的氨基酸序列；或，
所述VL包含如SEQIDNO:12所示的VLCDR1、SEQIDNO:13所示的VLCDR2和SEQIDNO:14所示的VLCDR3的氨基酸序列；所述VH包含如SEQIDNO:15所示的VHCDR1、SEQIDNO:16所示的VHCDR2和SEQIDNO:17所示的VHCDR3的氨基酸序列。


如权利要求1或2所述的靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体的CDR突变序列为CDR区发生脱氨基化敏感位点突变的序列；优选地，所述CDR区脱氨基化敏感位点为轻链CDR1第L30A和/或L30B；和/或，重链CDR3第H99和/或H100位；
更优选地，所述轻链CDR1第L30A和L30B的氨基酸残基由NS突变为TS或NT，且前提是第L30E位不为Q和第L34位不为T；所述重链CDR3第H99和H100位的氨基酸残基由NS突变为TS或NT，且前提是轻链CDR1第L30E位不为Q和第L34位不为T。


如权利要求1-3中任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体为鼠源抗体；
优选地，所述鼠源抗体的VL为如SEQIDNO:7所示的氨基酸序列或其突变；和/或，所述鼠源抗体的VH为如SEQIDNO:8所示的氨基酸序列或其突变；所述突变为所述VL和/或VH的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述VL和/或VH的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述抗体与CLDN18.2的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性；更优选为至少95％序列同一性；最优选为至少99％序列同一性。


如权利要求4所述的靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体包含鼠源抗体的可变区和鼠或人抗体恒定区；所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b3或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区，所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区；
优选地，所述靶向CLDN18.2的抗体为鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区组合成的嵌合抗体；
更优选地，所述嵌合抗体的轻链氨基酸序列为如SEQIDNO:9所示的氨基酸序列或其突变；和/或，所述嵌合抗体的重链氨基酸序列为如SEQIDNO:10所示的氨基酸序列或其突变。


如权利要求1-3中任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，所述靶向CLDN18.2的抗体为人源化抗体；
优选地，所述人源化抗体的VL包含如SEQIDNO:29-33中任一个所示的氨基酸序列或其突变；和/或，所述人源化抗体的VH序列如包含如SEQIDNO:34-37中任一个所示的氨基酸序列或其突变；所述突变为所述VL和/或VH的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加，且所述突变的氨基酸序列与所述VL和/或VH的氨基酸序列具有至少85％序列同一性，并保持或改善了所述抗体与CLDN18.2的结合；所述至少85％序列同一性优选为至少90％序列同一性；更优选为至少95％序列同一性；最优选为至少99％序列同一性；
更优选地，所述VL包含如SEQIDNO:29所示的氨基酸序列；所述VH如包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列；或，所述VL包含如SEQIDNO:31所示的氨基酸序列；所述VH包含如SEQIDNO:34所示的氨基酸序列。


如权利要求6所述的靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链包含选自人抗体κ或λ型轻链恒定区或其突变；和/或，所述抗体的重链包含选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其突变；
优选地，所述重链恒定区或其突变，包含人IgG1Fc区第234位、第235和第243位，或第239、第330和第332位突变；
更优选地，所述重链恒定区或其突变，包含人IgG1Fc区第356-358位为EEM或DEL的突变。


如权利要求6或7所述的靶向CLDN18.2的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链包含SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42或SEQIDNO:45所示的氨基酸序列或其突变；和/或，所述抗体的重链包含SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44或SEQIDNO:46所示的氨基酸序列或其突变。


如权利要求1-8中任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体，其包含以下轻链和重链：所述重链如SEQIDNO:39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQIDNO:38的氨基酸序列所示；或，所述重链如SEQIDNO:39的氨基酸序列所示，所述轻链如SEQIDNO:42的氨基酸序列所示。


如权利要求1-9中任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体，其中所述靶向CLDN18.2的抗体包括免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv或单链Fv片段(scFv)。



一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其特征在于，所述第一蛋白功能区为如权利要求1-10任一项所述的靶向CLDN18.2的抗体；所述第二蛋白功能区为靶向非CLDN18.2抗原的抗体。


如权利要求11所述的双特异性抗体，其特征在于，所述非CLDN18.2抗原为免疫检查点抗原或肿瘤治疗靶点，所述免疫检查点抗原优选包括PD-1、PD-L1、Tim3、LAG3、CD47，所述肿瘤治疗靶点优选包括SIRPα；优选地，所述第二蛋白功能区抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗LAG3抗体、抗CD47抗体、抗CD3抗体和抗CSF-1R抗体；最优选地，所述抗PD-1抗体为Nivolumab、Pembrolizumab或者Ba08，所述抗PD-L1抗体为Atezolumab、Avelumab或者Durvalumab，所述抗CD47抗体为hu5F9或iMab，所述抗CD3抗体为Blincyto或AMG420中由结合CD3的轻、重链可变区序列构建的抗体；
或，所述非CLDN18.2抗原为细胞因子和细胞因子受体或它们的片段；优选地，所述细胞因子包括TGFβ、IL10和CSF-1，所述细胞因子受体包括TGFβRII、IL10受体和CSF-1R。


如权利要求12所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为一个或多个scFv、细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段；或者，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，所述的第一蛋白功能区为一个或多个scFv；其中，所述scFv包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接；所述scFv、细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段通过连接子与所述免疫球蛋白连接，所述连接子优选(G
4S)
w；所述的w优选为0～10之间的整数，更优选为1、2、3或者4。



根据权利要求13所述的双特异性抗体，其特征在于，所述scFv的结构为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区N末端或重链可变区C末端分别通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；或所述scFv的结构为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端分别通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端；优选地，所述连接子为(G
4S)
3，和/或，所述scFv的数量为两个且对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链；

更佳地，所述的双特异性抗体选自以下任一种：
(1)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包括轻链如SEQIDNO:38所示、重链如SEQIDNO:39所示的氨基酸序列；所述第二蛋白功能区为scFv；其中，
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端；且，所述scFv的轻链可变区为Atezolumab的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Atezolumab的重链可变区；或，
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链可变区的N末端；且，所述scFv的轻链可变区为Hu5F9的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为Hu5F9的轻链可变区；或，
两个scFv的重链可变区的N末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端；且，所述scFv的轻链可变区为AMG420的轻链可变区，所述scFv的重链可变区为AMG420的重链可变区；
(2)所述第一蛋白功能区为scFv，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端；所述scFv的轻链可变区的序列如SEQIDNO:29所示，所述scFv的重链可变区的序列如SEQIDNO:34所示；其中，
所述免疫球蛋白包括Nivolumab的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Nivolumab的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列；或，
所述免疫球蛋白包括Pembrolizumab的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Pembrolizumab的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列；或，
所述免疫球蛋白包括Atezolumab的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Atezolumab的重链可变区以及重链恒定区为hIgG1的氨基酸序列。


根据权利要求13所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段；所述细胞因子或它的片段、或细胞因子受体或它的片段的数量优选为两个或四个；其通过连接子对称地与所述免疫球蛋白两条轻链和/或两条重链的C末端和/或N末端连接，所述连接子优选为(G
4S)
3；

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳建，
申请(专利权)人：上海健信生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31