三特异性抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种三特异性抗体及其应用。所述三特异性抗体包含分别靶向Claudin18.2、免疫检查点和细胞因子或其受体的三种蛋白功能域；相邻蛋白功能域之间以连接子连接，或直接连接。本发明专利技术的三特异性抗体保留了与靶点的结合活性，并且具有良好的体内药效；并且分子量小，结构类似常规IgG，有完整的Fc，为下游生产纯化工艺提供便利，节约成本；此外，本发明专利技术的三特异性抗体与正常抗体分子量大小接近，使其更易于进入肿瘤组织，达到杀伤肿瘤的效果，更适合用于抗肿瘤药物的开发，为肿瘤治疗提供了更好的选择。更好的选择。更好的选择。

【技术实现步骤摘要】
三特异性抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种三特异性抗体及其应用。

技术介绍

[0002]细胞连接密蛋白(密蛋白，Claudin或CLDN)在人、鼠等物种中都有表达，是细胞间层密封关联蛋白，在控制对细胞层间离子流、维持细胞极性和细胞间信号转递具有重要作用。CLDN家族蛋白已经发现的有29种之多，CLDN18就是其中之一。CLDN18有两个同源分子，分别称为密蛋白18.1(CLDN18.1)和密蛋白18.2(CLDN18.2)。人密蛋白18.1(hCLDN18.1)和人密蛋白18.2(hCLDN18.2)高度同源，氨基酸同源性高达92％。hCLDN18.2在正常组织表达非常有限，仅见于胃黏膜分化上皮细胞，但在胃癌包括转移胃癌组织有特别的高表达(Sahin U.et al.Claudin
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18splice variant 2is a pan
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cancer target suitable for therapeutic antibody delveopment.Clin Cancer Res.2008；14(23):7642
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34)。进一步发现，CLDN18.2在不同癌症，包括大约70％的胃癌、50％的胰腺癌、30％的食道癌、25％的肺癌和卵巢癌等的患者组织都有表达。因此，CLDN18.2早已经成为理想的肿瘤患者标记物和抗肿瘤药物开发靶点，特别是靶向CLDN18.2的抗体开发用于肿瘤治疗，但因为靶点的特殊性，开发针对CLDN18.2治疗性抗体非常困难。人CLDN18.2蛋白全长261个氨基酸，见NCBI公开序列NP_001002026.1claudin
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18isoform 2，其中1
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23为信号肽。CLDN18.2蛋白是一个跨膜蛋白，有两个膜外区域分别为信号肽后面大约55个氨基酸的胞外区1(Extracellular loop 1，ECL1)和23个氨基酸ECL2。这一结构和人CLDN18.1非常相似，而且人CLDN18.2和人CLDN18.1的ECL2区域则完全相同。因而针对人CLDN18.2蛋白靶点抗体的开发，需要寻找针对人CLDN18.2蛋白的ECL1区域或空间结构的抗体。
[0003]此外，针对人CLDN18.2膜蛋白的抗体发挥其功效至少包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长，通过和病人免疫细胞的效应作用，包括抗体依赖细胞毒性(ADCC)，和补体依赖细胞毒性(CDC)效应细胞介导的杀伤肿瘤细胞作用。
[0004]转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF
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β)信号通路是一个包含众多成员的多功能细胞因子的大家族，包括TGF
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β1、TGF
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β2、TGF
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β3及其他信号蛋白。TGF
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β三种亚型的一级结构相似度较高，同源性达到70
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80％。它们都具有信号肽、一个LAP结构域和一个由112
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114个氨基酸残基组成的C末端区域，这一肽段经蛋白水解、释放后成为成熟的TGF
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β分子，成熟的TGF
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β蛋白二聚体化生成25KDa的活性蛋白。TGF
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β都具有9个半胱氨酸残基，其中8个在分子内形成二硫键，从而形成TGF
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β超家族的半胱氨酸结(cysteine knot)结构特征。第9个半胱氨酸与另一个TGF
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β蛋白的对应半胱氨酸形成二硫键，从而形成具有功能的二聚体。TGF
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β主要通过调节细胞的生长、增殖、分化、迁移和凋亡等过程，参与介导组织与器官的正常生长和发育、机体的免疫反应等生物过程。活化的TGF
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β释放后再与其他因子形成丝氨酸/苏氨酸激酶复合物，最终与TGF
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β受体结合，激活下游信号通路。TGF
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β受体下游信号通路可分为经典通路(SMAD通路)和DAXX依赖凋亡通路。当人体细胞出现癌变时，肿瘤微环境中的基质细胞和肿瘤浸润区巨噬细胞就会分泌TGF
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β。TGF
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β的肿瘤抑制作用源
自其诱导多个基因表达的能力，这些基因参与抑制细胞增殖、诱导凋亡、激活自噬、通过基质成纤维细胞抑制生长因子的信号、抑制炎症，以及抑制血管生成。这些作用维持了正常组织内的动态平衡，防止肿瘤形成的早期阶段。不过，TGF
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β对恶变前癌细胞施加的压力，会迫使肿瘤细胞通过突变等手段避开TGF
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β的抑制作用。首先，TGF
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β信号可作用于肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞，减弱了TME中固有免疫细胞的抗肿瘤能力、抑制CD8+T细胞的功能并促进肿瘤逃逸免疫监管；其次，TGF
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β信号可以通过诱导HMGA2、Snail1/2等转录因子的表达，诱发上皮
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间质转化(EMT)，进而逃逸凋亡作用；另外，TGF
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β表达上调，也会促进VEGF
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A等因子的分泌，刺激新生血管生成，从而为癌细胞的生长和转移提供助力。近期的研究还表明，TGF
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β信号通路还与肿瘤细胞的耐药性相关。比如，它可以使肿瘤细胞避开一些化疗药物的杀伤作用，它也可以通过上调蛋白激酶Cα(PKCα)表达增强肿瘤细胞的耐药性。
[0005]针对CLDN18.2靶点目前有9个单抗(安斯泰来的Zolbetuximab、恺兴生命科技的AB011、奥赛康的ASKB589、迈博斯的TST001、明济生物的M108、天广实的MIL93、礼新生物的LM
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102、创胜集团的NBL
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015和恒瑞医药的SHR
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A1904)、3个双特异性抗体(安进/百济的CD3
×
Claudin 18.2、齐鲁制药的CD3
×
Claudin 18.2和启愈生物的PD
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L1
×
Claudin 18.2)在临床阶段，尚无多特异性抗体公布。目前，已有的抗体仅靶向CLDN18.2靶点或者包括CLDN18.2在内的2个肿瘤靶点，不能靶向更多的通路或者肿瘤微环境中促进肿瘤进展或增强免疫的因子，临床效果有限。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的是技术问题是克服现有技术中缺少同时靶向三个不同通路或免疫调节因子的缺陷，提供一种三特异性抗体及其应用。本专利技术同时靶向三个不同靶点，可作为肿瘤细胞与免疫细胞的衔接器，同时解除免疫细胞的免疫抑制、解除肿瘤微环境的免疫抑制，并可在肿瘤细胞周围招募更多的免疫细胞，取得了更好的协同疗效的同时避免了非肿瘤特异的副作用。
[0007]专利技术人通过对三特异性抗体分子的结构进行创新性的设计、筛选，发现三特异性分子中序列的改变及其连接方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三特异性抗体，其特征在于，其包含分别靶向Claudin18.2、免疫检查点和细胞因子或其受体的三种蛋白功能域；相邻蛋白功能域之间以连接子连接，或直接连接；其中，靶向Claudin18.2的蛋白功能域包括轻链可变区VL1和重链可变区VH1，靶向免疫检查点的蛋白功能域包括轻链可变区VL2和重链可变区VH2；所述VL1和VH1的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5和6所示；所述细胞因子选自白细胞介素IL例如IL
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2、IL
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6、IL
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8、IL
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10、IL
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12、IL
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15、IL
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17和TGF
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β家族例如TGF
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β1、TGF
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β2或TGF
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β3，所述细胞因子受体为TGF
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βRI或TGF
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βRII。2.如权利要求1所述的三特异性抗体，其特征在于，所述免疫检查点为免疫细胞检查点；较佳地，所述免疫细胞检查点为PD
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1或PD
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L1；更佳地，所述VL2和VH2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和8所示，或如SEQ ID NO:9和10所示；和/或，所述IL
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10和TGF
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βRII的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。3.如权利要求1或2所述的三特异性抗体，其特征在于，所述三特异性抗体还包括恒定区，所述恒定区包括轻链恒定区和/或重链恒定区；较佳地，所述重链恒定区为hIgG1或hIgG4的重链恒定区；和/或，所述轻链恒定区包括κ链或λ链；和/或，三种蛋白功能域各为2份；更佳地，所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域的N端连接所述靶向免疫检查点的蛋白功能域的C端，或，所述靶向免疫检查点的蛋白功能域的N端连接所述靶向Claudin18.2的蛋白功能域的C端；和/或，所述重链恒定区的N端连接所述靶向免疫检查点的蛋白功能域或靶向免疫检查点的蛋白功能域的C端，所述重链恒定区的C端连接所述靶向细胞因子或其受体的蛋白功能域的N端；所述重链恒定区的C末端氨基酸优选为A；进一步更佳地：所述VL1、VH1、VL2、VH2的结构从N端至C端依次为VL1
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VH1
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VH2
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VL2、VH1
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VL1
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VL2
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VH2、VL2
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VH2
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VL1
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VH1或VH2
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VL2
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VH1
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VL1；或，所述VL1、VH1、VL2、VH2的结构从N端至C端依次为VL1
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VL2
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VH2
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VH1或VL2
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【专利技术属性】
技术研发人员：邓洪渊，王凤坡，王翠辉，张振，栾彦，刘佳建，
申请(专利权)人：上海健信生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：