用于制备抗体文库和从其分离的抗体的方法和组合物技术

本文提供的实施方式涉及抗体的产生和鉴定、抗体文库和在鸡中产生的抗体文库及其使用方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备抗体文库和从其分离的抗体的方法和组合物


[0001]本申请涉及用于制备抗体文库和从其分离的抗体的方法和组合物。

技术实现思路

[0002]在一些实施方式中，提供了产生核酸分子群的方法，所述核酸分子群编码侧翼为两个人框架区(FR)的鸡互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，所述方法包括：a)在足以产生编码鸡互补决定区(CDR)的扩增的核酸分子群的条件下，用第一引物和第二引物扩增编码鸡抗体的第一核酸分子群，其中：所述第一引物退火至所述鸡抗体CDR的上游区域，其中所述第一引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧上游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且所述第二引物退火至所述鸡抗体CDR下游一定距离处的区域。在一些实施方式中，限制性位点可以在CDR的上游以产生第一核酸群。在一些实施方式中，限制性位点可以在CDR的下游以产生第一核酸群。
[0003]在一些实施方式中，提供了产生编码抗体的人源化可变区的核酸分子文库的方法。在一些实施方式中，所述方法包括组合：i)编码鸡互补决定区1(CDR1)结构域的第一核酸分子文库，侧翼为编码人框架区1(FR1)和人框架区2(FR2)的核酸序列；ii)编码鸡互补决定区2(CDR2)结构域的第二核酸序列文库，侧翼为编码人框架区2(FR2)和人框架区3(FR3)的核酸序列；iii)编码鸡互补决定区3(CDR3)结构域的第三核酸序列文库，侧翼为编码人框架区3(FR3)和人框架区4(FR4)的核酸序列，其中所述编码抗体的人源化可变区的核酸分子具有下式：
[0004]FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4，
[0005]其中
[0006]FR1是人FR1；
[0007]CDR1是鸡CDR1；
[0008]FR2是人FR2；
[0009]CDR2是鸡CDR2；
[0010]FR3是人FR3；
[0011]CDR3是鸡CDR3；并且
[0012]FR4是人FR4。
[0013]在一些实施方式中，提供了核酸分子文库，其中所述文库是根据本文提供的方法制备的。
[0014]在一些实施方式中，提供了退火至鸡CDR紧上游的区域的寡核苷酸。在一些实施方式中，提供了退火至鸡抗体CDR紧上游的区域的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点由在识别位点下游一定距离处切割的限制酶识别。
[0015]在一些实施方式中，提供了由具有下式的核酸分子编码的多肽：
[0016]FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4，
[0017]其中
[0018]FR1是人FR1；
[0019]CDR1是鸡CDR1；
[0020]FR2是人FR2；
[0021]CDR2是鸡CDR2；
[0022]FR3是人FR3；
[0023]CDR3是鸡CDR3；并且
[0024]FR4是人FR4，
[0025]其中所述核酸分子根据本文提供的方法制备。
[0026]在一些实施方式中，提供了鉴定靶标的结合配偶体的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使靶标与由根据本文提供的方法制备的文库编码的蛋白质文库接触。
附图说明
[0027]图1例示了引物设计的非限制性实例。带下划线的序列代表IIS型限制酶AcuI的识别位点。
[0028]图2例示了用于从鸡抗体中提取CDR并将CDR嵌入侧翼人框架区的非限制性过程。
[0029]图3例示了来自根据本文提供的实施方式产生的抗体的单克隆scFv结合。例示了91个亲和力成熟的scFv克隆的靶标结合。将这些scFv提取物针对它们的靶抗原和作为对照的第二不相关膜蛋白进行了测试。条形图描绘了scFv提取物与靶抗原的结合。虚线表示20倍信号:背景比(靶标结合)。>50％的克隆显示比与不相关蛋白质的结合高20倍的靶标结合。
具体实施方式
[0030]如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个或一种(a)”、“一个或一种(an)”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。
[0031]如本文所用，术语“包含”、“具有”、“有”和“包括”及其变体，如本文所用，是指“包括但不限于”。虽然各种组合物和方法被描述为“包含”各种组分或步骤(解释为意指“包括但不限于”)，但组合物、方法和装置也可以“基本上由各种组分或步骤组成”或“由各种组分或步骤组成”，并且此类术语应解释为定义基本上封闭成员组。
[0032]本文提供的实施方式部分地涉及产生编码CDR的核酸分子文库的方法。这些CDR可以源自，例如，在鸡中产生的抗体。在一些实施方式中，文库包含编码包含三个CDR的多肽的核酸分子，每个CDR源自鸡抗体。
[0033]例如，在一些实施方式中，提供了产生核酸分子群的方法，所述核酸分子群编码侧翼为两个人框架区(FR)的鸡互补决定区(CDR)。
[0034]在一些实施方式中，所述方法包括：a)在足以产生编码鸡互补决定区(CDR)的扩增的核酸分子群的条件下，用第一引物和第二引物扩增编码鸡抗体的第一核酸分子群，其中：所述第一引物退火至所述鸡抗体CDR的上游区域，其中所述第一引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧上游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且所述第二引物退火至所述鸡抗体CDR下游一定距离处的
区域。在一些实施方式中，紧上游的切割是CDR边界的约1、2、3、4或5个核苷酸。在优选的实施方式中，紧上游的切割是CDR边界的约1、2或3个核苷酸。在一些实施方式中，第二引物退火至距离鸡抗体CDR下游不大于mRNA转录物长度处的区域。
[0035]在一些实施方式中，该方法进一步包括用所述限制酶消化扩增的核酸分子群以在编码CDR的序列的紧上游(例如，1、2、3或4个核苷酸碱基)产生5'突出端以产生消化产物。在优选的实施方式中，编码CDR的序列紧下游的5'突出端是CDR边界的1、2或3个核苷酸。在一些实施方式中，连接位点/突出端也可以是CDR中的残基。例如，CDR
‑
L3和CDR
‑
H3的5
’
连接位点是CDR上游的半胱氨酸。在一些实施方式中，这被认为是CDR的一部分，取决于CDR命名约定。因此，在一些实施方式中，突出端是CDR边界外的1(
‑
1)或2(
‑
2)个核苷酸。
[0036]在一些实施方式中，该方法包括通过将所述消化产物连接至编码人抗体的第一FR的核酸序列来制备第一连接产物，其中所述人抗体的第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生核酸分子群的方法，所述核酸分子群编码侧翼为两个人框架区(FR)的鸡互补决定区(CDR)，所述方法包括：a)在足以产生编码鸡互补决定区(CDR)的扩增的核酸分子群的条件下，用第一引物和第二引物扩增编码鸡抗体的第一核酸分子群，其中：所述第一引物退火至所述鸡抗体的CDR的上游或下游区域，其中所述第一引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧上游或下游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且如果所述第一引物在所述CDR上游退火，则所述第二引物退火至所述鸡抗体的CDR的下游一定距离处的区域；或如果所述第一引物在所述CDR下游退火，则所述第二引物退火至所述鸡抗体的CDR的上游一定距离处的区域。2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括用所述限制酶消化所述扩增的核酸分子群以在编码所述CDR的序列的紧上游产生5'突出端以产生消化产物。3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括通过将所述消化产物连接至编码人抗体的第一FR的核酸序列来制备第一连接产物，其中，所述人抗体的第一FR在其3'端包括与所述消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得所述第一FR连接至第一消化产物的上游。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸的位置处切割，其中所述边界在编码所述CDR的序列的内部或外部。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸的位置处切割。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶在距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二引物退火至距离所述鸡抗体的CDR的下游或上游不大于mRNA转录物长度处的区域。10.根据权利要求2所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸。11.根据权利要求10所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2或3个核苷酸。12.根据权利要求3所述的方法，所述方法进一步包括在足以产生编码鸡CDR的第二扩增的核酸分子群的条件下，用第三引物和第四引物制备第二扩增的核酸分子群，其中：所述第三引物退火至所述第一连接产物中存在的编码所述CDR的核酸序列紧下游的区域，其中所述第三引物包含限制酶识别位点，所述限制酶识别位点被限制酶识别，所述限制酶在所述CDR的紧下游并且与所述识别位点相距一定距离的位置处切割；并且所述第四引物在所述连接产物中CDR上游一定距离处退火至所述第一连接产物中存在
的编码所述第一FR的核酸分子的一部分。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸的位置处切割。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸的位置处切割。15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述限制酶在距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述限制酶在CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述限制酶在所述CDR边界的1、2或3个核苷酸且距离所述识别位点至少10个核苷酸的位置处切割。18.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第二引物退火至距离所述鸡抗体的CDR的下游不大于mRNA转录物长度处的区域。19.根据权利要求12所述的方法，进一步包括用所述限制酶消化所述第二扩增的核酸分子群以在编码所述CDR的序列的紧下游产生5'突出端以产生第二消化产物。20.根据权利要求19所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是CDR边界的1、2、3、4或5个核苷酸。21.根据权利要求20所述的方法，其中，紧下游的所述5'突出端是所述CDR边界的1、2或3个核苷酸。22.根据权利要求19所述的方法，进一步包括将所述第二消化产物连接至编码人抗体的第二FR的核酸序列以产生第二连接产物，其中，所述第二FR在其5'端包括与所述第二消化产物的突出端区域相容的突出端区域，使得所述第二FR连接至所述第二消化产物的下游。23.根据权利要求22所述的方法，进一步包括在足以产生编码侧翼为人抗体的两个FR的所述CDR的核酸分子群的条件下，用退火至所述人抗体的第一FR的第一FW引物和退火至所述人抗体的第二FR的第二引物扩增所述第二连接产物。24.根据权利要求1
‑
23中任一项所述的方法，其中，所述CDR是鸡CDR1、CDR2或CDR3。25.根据权利要求1
‑
24中任一项所述的方法，其中，所述FR是人FR1、FR2、FR3或FR4。26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述第一FR是人FR1并且所述第二FR是人FR2。27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述第一FR是人FR2并且所述第二FR是人FR3。28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述第一FR是人FR3并且所述第二FR是人FR4。29.根据权利要求1所述的方法，其中，所述限制酶是IIS型酶。30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述IIS型酶是在距离识别序列大于至少10个碱基的距离处切割的任何IIS型酶。31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述IIS型酶在距离所述识别序列14
‑
21个碱基的距离处切割。32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述IIS型酶是AcuI、BpmI、BpuEI、BsgI、MmeI或NmeAllI。33.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法进一步包括产生编码包括鸡CDR1、鸡
CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸。34.根据权利要求33所述的方法，其中，产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸包括对根据权利要求1
‑
32中任一项所述的方法产生的第一连接产物、第二连接产物和第三连接产物进行重叠PCR，其中：所述第一连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；所述第二连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且所述第三连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。35.根据权利要求33所述的方法，其中，产生编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3且每个CDR侧翼为人框架区的蛋白质的核酸包括连接根据权利要求1
‑
32中任一项所述的方法产生的第一连接产物、第二连接产物和第三连接产物，其中：所述第一连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR1的核酸分子；所述第二连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR2的核酸分子；并且所述第三连接产物包括编码侧翼为人框架区的鸡CDR3的核酸分子。36.根据权利要求33
‑
35中任一项所述的方法，其中，编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的所述核酸分子具有下式：FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4，其中FR1是人FR1；CDR1是鸡CDR1；FR2是人FR2；CDR2是鸡CDR2；FR3是人FR3；CDR3是鸡CDR3；并且FR4是人FR4。37.根据权利要求33
‑
35中任一项所述的方法，其中，编码包括鸡CDR1、鸡CDR2和鸡CDR3的蛋白质的所述核酸分子编码抗体可变区。38.根据权利要求1
‑
37中任一项所述的方法，其中，所述第一引物和第三引物包括核酸序列，所述核酸序列包括下式：5
’‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：整体分子公司，
类型：发明
国别省市：