一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术属于肿瘤细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用。该嵌合抗原受体包括依次连接的胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述胞外结构域包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体。所述胞外结构域还包括CD8信号肽，其包含如SequenceNO.2所示的氨基酸序列或其功能性变体。该嵌合抗原受体及其CAR

【技术实现步骤摘要】
一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤细胞免疫治疗
，具体涉及一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及其应用。

技术介绍

[0002]CAR
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T全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是模拟TCR功能的人工受体，包括依次连接的包含ScFv的胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种共刺激分子相连，如4
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1BB，CD28，ICOS(CD278)。CAR分子包含的ScFv对肿瘤抗原具有特异性识别的特点，通过铰链区和跨膜区进行T细胞激活细胞传递。目前临床上CAR
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T治疗主要运用于血液瘤系统的肿瘤治疗。
[0003]CD70是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员之一，是一种Ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于活化的T细胞、B细胞、自然杀伤细胞以及树突状细胞中。CD70的受体是CD27,CD70与CD27相互作用促进T细胞和B细胞的活化、增殖及分化，在调控免疫应答过程中发挥重要作用。CD70仅短暂的表达于活化的淋巴细胞中，但其在多种肿瘤组织中高水平表达，目前证实的高表达CD70的肿瘤组织包括肾癌、血源性恶性肿瘤、胸腺肿瘤、卵巢癌、成神经胶质细胞瘤、鼻咽癌等多种肿瘤组织。使其可能成为肿瘤免疫治疗的一个有效的靶点。
[0004]CD70相较于传统的CAR
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T靶点适应症更广、安全性高，并且覆盖血液系统肿瘤和实体瘤，是具有潜力的CAR
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T治疗靶点，目前还未有相关靶点药物上市。国外有相关的单抗和ScFv在研，国内尚无，开发靶向全人源化的CD70的嵌合抗原受体非常有必要，开发靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体及CAR
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T细胞制品具有极大的临床应用价值，涉及CAR
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T时，所针对的抗原基因序列的选择是关键性的选择，鉴于体内基因表达的复杂性以及各种不可控隐私，选择到一个合适的可以用于CAR
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T的基因是非常困难的，这是发展CAR
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T技术的难点。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术目的在于提供一种靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体与运载体结合转染T细胞后，可以精准识别CD70靶点，并对靶细胞进行有效杀伤。
[0006]所述靶向CD70的嵌合抗原受体，包括胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述胞外结构域包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体。
[0007]在某些具体实施例中，胞外结构域包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体，即靶向CD70的ScFv，其制备方法是通过噬菌体展示技术构建全人源的单链抗体库，通过适当方法的亲和淘选，富集携带某种具有特异亲和力片段的噬菌体，测序即可获得其基因序列。为筛选到靶向CD70抗原的人源抗体，构建了全人源的单链抗体库，以正常人的PBMC为原材料，抽提总RNA反转录cDNA，扩增抗体可变区，通过连接肽(Linker)将重链可变区VH与轻链可变区VL连接起来，将其构建至噬菌粒载体，电转至展示菌株，构建抗体库，由CD70胞外段抗原对文库进行淘选，对筛选出的克隆进行鉴定，最终获得了具有特异性结合
CD70抗原的ScFv。在进行构建嵌合抗原受体或其他用途时，对ScFv进行PCR人工合成即可得到大量靶向CD70的ScFv，即得到包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体的胞外结构域。
[0008]进一步，所述胞外结构域还包括CD8信号肽，其包含如SequenceNO.2所示的氨基酸序列或其功能性变体。CD70抗体是在所述CD8信号肽的引导下定位在细胞膜上，如本领域技术人员所知，所有其他的可用于CAR或者抗体领域的信号肽都可以用于本专利技术中，胞外段一般包含CD8α或GM
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CSFRα信号肽。
[0009]进一步，所述铰链可以来源于：IgG、CD8、CD7、CD4及其功能性变体；所述铰链区优选包含以下任选氨基酸序列中的一种或其功能性变体：SequenceNO.3、SequenceNO.4、SequenceNO.5、SequenceNO.6，可以使得得到的嵌合抗原受体起到更好的细胞杀伤效果和更好的刺激细胞因子分泌。
[0010]进一步，所述跨膜区可以来源于：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD16、CD137、CD80以及CD86；同理，所述跨膜区优选包含以下任选氨基酸序列中的一种或其功能性变体：SequenceNO.7、SequenceNO.8。
[0011]进一步，所述胞内信号域包含信号传导区和共刺激结构域，所述胞内信号传导区与共刺激结构域可来源于：CD3、CD137、CD28、CD27、OX40、ICOS、GITR、CD2、CD40、PD
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1、PD1L、B7
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H3、淋巴细胞功能相关抗原
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1(LFA
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1)、ICAM
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1、CD7、NKG2C、CD83、CD86以及CD127；所述信号传导区优选包含SequenceNO.9或SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述共刺激结构域优选包含以下任选的氨基酸序列中的一种或多种或其功能性变体的一种或多种：SequenceNO.10、SequenceNO.11、SequenceNO.12。
[0012]在某些具体实施例中，所述嵌合抗原受体包括以下任选组合中的一种：
[0013]组合1)：所述铰链区包含如SequenceNO.3所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.7所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.10的序列氨基酸序列或其功能性变体；
[0014]组合2)：所述铰链区包含如SequenceNO.4所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.11的所示的氨基酸序列或其功能性变体；
[0015]组合3)：所述铰链区包含如SequenceNO.6所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述所述胞内信号域包含如SequenceNO.9所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.12所示的氨基酸序列或其功能性变体；
[0016]组合4)：所述铰链区包含如SequenceNO.5所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含Seque本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向全人源化CD70的嵌合抗原受体，其特征在于，包括胞外结构域、铰链区和跨膜区及胞内信号域，所述胞外结构域包括如SequenceNO.1所示的氨基酸序列或其功能性变体。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链区包含以下任选氨基酸序列中的一种或其功能性变体：SequenceNO.3、SequenceNO.4、SequenceNO.5、SequenceNO.6。3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述跨膜区包含以下任选氨基酸序列中的一种或其功能性变体：SequenceNO.7、SequenceNO.8。4.根据权利要求3所述的额嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号域包含信号传导区和共刺激结构域，所述信号传导区包含SequenceNO.9或SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述共刺激结构域包含以下任选的氨基酸序列中的一种或多种或其功能性变体的一种或多种：SequenceNO.10、SequenceNO.11、SequenceNO.12。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括以下任选组合中的一种：组合1)：所述铰链区包含如SequenceNO.3所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.7所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.10的序列氨基酸序列或其功能性变体；组合2)：所述铰链区包含如SequenceNO.4所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.11的所示的氨基酸序列或其功能性变体；组合3)：所述铰链区包含如SequenceNO.6所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述所述胞内信号域包含如SequenceNO.9所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.12所示的氨基酸序列或其功能性变体；组合4)：所述铰链区包含如SequenceNO.5所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.9所示的氨基酸序列或其功能性变体和SequenceNO.12所示的氨基酸序列或其功能性变体；组合5)：所述铰链区包含如SequenceNO.6或SequenceNO.5或SequenceNO.21所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述跨膜区包含如SequenceNO.7所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述胞内信号域包含SequenceNO.34所示的氨基酸序列或其功能性...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐亚男，陈军，赵文旭，么瑞娜，黄霞，沈俊杰，徐艳敏，洪娟，杨智，
申请(专利权)人：重庆精准生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：