携带GITR共刺激信号靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞制造技术

本发明专利技术涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其从N端到C端包含：(i)包含VH和VL的单链可变区片段(scFv)，其中scFv对人表皮生长因子受体(EGFR)具有低亲和力，解离常数(K

Chimeric antigen receptor T cells targeting EGFR with GITR costimulatory signal

【技术实现步骤摘要】
携带GITR共刺激信号靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞
本专利技术涉及肿瘤治疗
，更具体地涉及携带GITR共刺激信号靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞，其可以有效攻击过表达EGFR的肿瘤细胞而不会攻击EGFR阴性的肿瘤细胞。
技术介绍
免疫治疗是一种新兴的非常有前景的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的有效武器，它们能够持续性地搜寻外来抗原并从正常细胞中或非正常细胞，如癌症或被感染的细胞。基因修饰的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，代表了一种有效的免疫治疗方法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的T细胞可以在患者体内增殖并持续存在(“活的药物”)。CAR(嵌合抗原受体)通常是由一个单克隆抗体衍生的单链可变区片段(scFv)通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号结构域：(i)单个细胞活化的CD3-ζ结构域；(ii)和CD3-ζ结构域相连的CD28，CD137(4-1BB)或其他共刺激域(也可用CD27信号结构域代替CD28或CD137结构域)。CAR的发展从第一代(没有共刺激域)到第二代(具有一个共刺激域)到第三代CAR(具有多个共刺激域)。生成的具有多个共刺激域的CAR(即所谓的第三代CAR)会产生增加的细胞溶解活性，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。然而，目前嵌合抗原受体的研究还有很多不足，还存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的嵌合抗原受体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种携带GITR共刺激信号靶向EGFR的嵌合抗原受体T细胞。在本专利技术的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体融合蛋白，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：(i)包含VH和VL的单链可变区片段(scFv)，其中scFv对人表皮生长因子受体(EGFR)具有低亲和力，解离常数(KD)＞50nM,(ii)跨膜结构域，(iii)GITR共刺激结构域，和(iv)激活结构域。在另一优选例中，所述的scFv来源于C10抗体，并具有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列，或其至少90％的序列同一性。在另一优选例中，所述的scFv来源于P3-5抗体，并且具有其至少90％的序列同一性。在另一优选例中，所述的激活结构域是CD3ζ。在另一优选例中，所述的CAR具有下式I结构：L-scFv-H-TM-C-CD3ζ(I)式中，各“-”独立地为连接肽或肽键；L为任选的信号肽序列；scFv为对人表皮生长因子受体(EGFR)具有低亲和力，解离常数(KD)＞50nM的单链抗体；H为任选的铰链区；TM为跨膜结构域；C为GITR共刺激结构域；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。在本专利技术的第二方面，提供了一种核酸分子，所述的核酸分子编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的核酸序列如SEQIDNO：1所示，或在每个片段中具有其至少90％的同一性。在本专利技术的另一方面，提供了一种EGFRScFv-CD8铰链-CD28跨膜结构域-GITR结构域-CD3ζ的核酸序列，所述的核酸序列如SEQIDNO：1所示，或在每个片段中具有其至少90％的同一性。在本专利技术的另一方面，提供了一种由本专利技术第二方面所述的核酸序列编码的蛋白。在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第二方面所述的核酸分子。在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。在另一优选例中，所述核酸分子位于慢病毒载体的XbaI和EcoRI慢病毒位点中。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本专利技术第二方面所述的核酸分子或表达本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述细胞为T细胞。在本专利技术的第五方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本专利技术第一方面所述的融合蛋白，包括以下步骤：将本专利技术第二方面所述的核酸分子或本专利技术第三方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。在本专利技术的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本专利技术第一方面所述的融合蛋白、本专利技术第二方面所述的核酸分子、本专利技术第三方面所述的载体、或本专利技术第四方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。在本专利技术的第七方面，提供了一种本专利技术第一方面所述的融合蛋白、本专利技术第二方面所述的核酸分子、本专利技术第三方面所述的载体、或本专利技术第四方面所述的细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。在另一优选例中，所述肿瘤为EGFR阳性的肿瘤，较佳地为EGFR高表达的肿瘤。在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：/n(i)包含V

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体融合蛋白，所述的融合蛋白从N-末端到C-末端包含：
(i)包含VH和VL的单链可变区片段(scFv)，其中scFv对人表皮生长因子受体(EGFR)具有低亲和力，解离常数(KD)＞50nM,
(ii)跨膜结构域，
(iii)GITR共刺激结构域，和
(iv)激活结构域。


2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述的scFv来源于C10抗体，并具有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列，或其至少90％的序列同一性。


3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述scFv来源于P3-5抗体，并且具有其至少90％的序列同一性。


4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述激活结构域是CD3ζ。


5.一种核酸分子，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹卫，
申请(专利权)人：亘喜生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31