用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂技术

描述了用于减少针对测试样品中的PIVKA-II的免疫检验的非特异性结合的方法和试剂盒，其中使所述测试样品与抗凝血酶原抗体在一种或多种以下添加剂的存在下反应：脱脂乳、皂苷、CaCl2、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于减少非特异性结合的免疫检验方法和试剂相关申请信息本申请要求于2011年5月20日提交的美国临时申请系列号61/488,421的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。
本申请公开内容大体上涉及用于检测测试样品中的靶分析物的免疫检验方法、试剂和试剂盒，特别是涉及用于通过减少非特异性抗原-抗体相互作用而改善样品中PIVKA-II的测定的免疫检验方法、试剂和试剂盒。
技术介绍
最近数十年免疫检验技术已经广为人知，并且现在常出于各种各样的诊断目的而用于医学以检测测试样品中的靶分析物。免疫检验利用抗体与其相应的抗原的高度特异性结合，其中所述抗原是靶分析物。通常，通过诸如放射标记物或荧光标记物等某种形式的标记物实现抗体或抗原的定量。夹心免疫检验包括使样品中的靶分析物与抗体位置(其通常结合在固相载体上)结合，使经标记的抗体与捕获分析物结合，然后测定结合的标记抗体的量，其中所述标记物生成与靶分析物的浓度成比例的信号，这是因为除非分析物存在于样品中，否则标记的抗体不结合。可以以多种形式中的任一种进行免疫检验方法。典型的异相夹心免疫测定使用固相作为载体，所述载体上结合有与靶分析物上的至少一种表位具有反应性的第一(捕获)抗体。第二(检测)抗体也与靶分析物上的至少一种表位具有反应性，并且可以缀合至可检测标记物，所述可检测标记物提供在检测抗体与捕获的靶分析物结合之后测定的信号。PIVKA-II(“维生素K缺乏或拮抗剂诱导蛋白–II”)，也称为脱羧基凝血酶原(DCP)，是用于诊断肝细胞癌(HCC)和确定肝细胞癌(HCC)预后的肿瘤标志物。PIVKA-II也存在于维生素K缺乏或使用华法林的患者中。PIVKA-II检测方法的灵敏性对于建立在临床症状出现之前的诊断是重要的。可利用针对PIVKA-II的免疫检验，但是所用抗体和可存在于样品中的除PIVKA-II之外的抗原之间的非特异性结合相互作用减少了常用的截止水平的灵敏性和准确性。非特异性抗体/抗原相互作用能够增加假阳性诊断结果的风险和个体不能及时准确地获得诊断的风险。因此需要改善PIVKA-II免疫检验的灵敏性和准确性的方法。
技术实现思路
在一个方面，本申请公开内容提供测定测试样品中的PIVKA-II的方法，所述方法包括使所述测试样品与抗凝血酶原抗体在选自由以下添加剂组成的组的至少一种添加剂的存在下反应：脱脂乳、皂苷、CaCl2、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。所述添加剂可以在包含所述抗体和有效量的所述至少一种添加剂的免疫检验试剂中提供。所述抗体例如可包含抗凝血酶原单克隆抗体，例如MCA1-8。在另一方面，本申请公开内容提供一种改善针对PIVKA-II的特异性结合检验的灵敏性的方法，其中所述特异性结合检验包括第一反应和第二反应，所述第一反应产生包含与能够特异性结合PIVKA-II的一抗结合的PIVKA-II的第一复合物，所述第二反应包括使所述第一复合物与能够特异性结合PIVKA-II且与可检测标记物缀合的二抗接触，所述方法包括：向所述第二反应添加有效量的选自由脱脂乳、皂苷、CaCl2、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂组成的组的至少两种化合物。在以上方法中，向所述第二反应中添加有效量的所述至少两种化合物可以包括例如向所述第二反应添加稀释液，其中所述稀释液包含所述二抗和有效量的所述至少两种化合物。所述二抗例如包含抗凝血酶原单克隆抗体，例如MCA1-8。在任何方法中，所述免疫检验，也称为特异性结合检验，可以在固相上进行。所述固相可以包含磁性或顺磁性微粒。在任何以上方法中，可以使用至少两种、三种、四种添加剂。在示例性方法中，使用两种添加剂，它们是脱脂乳和皂苷。在任何以上方法中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂可以选自由以下物质组成的组：3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；ASB-14(酰氨基磺基甜菜碱-14)；和ASB-16(酰氨基磺基甜菜碱-16)。例如，在示例性方法中，脱脂乳、皂苷和3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)是所选择的添加剂。作为选择，所选择的添加剂可以是脱脂乳、皂苷和3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。在另一备选方案中，所选择的添加剂可以是脱脂乳、皂苷和3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。在又一备选方案中，所选择的添加剂是CaCl2和MgCl2中的一种和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂，其中所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂选自由以下物质组成的组：3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。在任何所述方法中，免疫检验可以包含竞争性免疫检验。可以在自动或半自动测定装置中进行免疫检验。免疫检验可以包含例如夹心检验。在另一方面，本申请公开内容提供用于改善针对PIVKA-II的特异性结合检验的灵敏性的免疫检验试剂，所述试剂包含有效量的选自由脱脂乳、皂苷、CaCl2、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂组成的组的至少一种添加剂。免疫检验试剂可以包含这些添加剂中的至少两种、至少三种或至少四种。在另一方面，本申请公开内容提供用于执行针对PIVKA-II的免疫检验的试剂盒，所述试剂盒包含能够特异性结合PIVKA-II的特异性结合试剂，和选自由以下添加剂组成的组的至少一种或至少两种、至少三种或至少四种添加剂：脱脂乳、皂苷、CaCl2、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。在试剂盒中，在免疫检验试剂中组合多于一种的添加剂。所述试剂盒还可以包含用于使测试样品与抗体在所述至少一种、至少两种、至少三种或至少四种添加剂的存在下反应，并用于将所述测试样品中的PIVKA-II的量定量的说明书。所述试剂盒还包含固相，其可以包括诸如磁性或顺磁性微粒等微粒。附图说明图1是使用经标记的抗凝血酶原单克隆抗体(MCA1-8IgG/F(ab’)2)缀合物来测定测试样品中的PIVKA-II的夹心免疫检验形式的示意图。图2是将使用不含添加剂的缀合物稀释液或者含有皂苷、脱脂乳或3-16作为缀合物稀释液中的添加剂的稀释液，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。图3是将使用不含添加剂的缀合物稀释液或含有皂苷、脱脂乳和3-16的组合作为缀合物稀释液中的添加剂的稀释液，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。图4是将使用不含添加剂的缀合物稀释液或含有所测试的数种磺基甜菜碱两性离子洗涤剂之一、皂苷和脱脂乳的组合的稀释液，根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。图5是将使用作为缀合物中的经标记的抗体的MCA1-8IgG、MCA1-8F(ab’)2、F3-4750IgG或F3-6542IgG，和不含添加剂的缀合物稀释液或含有30mMCaCl2或30mMMgCl2的稀释液在pH5.5和pH6.0时大体上根据图1的形式进行的免疫检验的灵敏性进行比较的柱状图。图6是包含两张柱状图的示意图，所述柱状图将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定测试样品中的PIVKA?II的方法，所述方法包括：使所述测试样品与抗凝血酶原抗体在选自由以下添加剂组成的组的至少一种添加剂的存在下反应：脱脂乳、皂苷、CaCl2、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.20 US 61/488,4211.选自由以下添加剂组成的组的至少一种添加剂在制造用于测定测试样品中的PIVKA-II的试剂盒中的应用：皂苷、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂，所述试剂盒还包含抗凝血酶原抗体，其中有效量的所述至少一种添加剂和所述抗凝血酶原抗体在稀释液中提供，其中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂选自由以下物质组成的组：3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；ASB-14(酰氨基磺基甜菜碱-14)；和ASB-16(酰氨基磺基甜菜碱-16)。2.如权利要求1所述的应用，其中，所述抗体包含单克隆抗体。3.如权利要求2所述的应用，其中，所述抗体包含MCA1-8。4.如权利要求1所述的应用，其中，所述测试样品与抗凝血酶原抗体在所述至少一种添加剂的存在下在固相上进行反应。5.如权利要求4所述的应用，其中，所述固相包含磁性微粒。6.如权利要求5所述的应用，其中，所述磁性微粒包含顺磁性微粒。7.如权利要求1所述的应用，其中，使用包括皂苷在内的至少两种添加剂。8.如权利要求1所述的应用，其中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂选自由以下物质组成的组：3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。9.如权利要求1所述的应用，其中，所选择的添加剂是皂苷和3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。10.如权利要求1所述的应用，其中，所选择的添加剂是皂苷和3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。11.如权利要求1所述的应用，其中，所选择的添加剂是皂苷和3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。12.如权利要求1所述的应用，其中，所选择的添加剂是MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂。13.如权利要求12所述的应用，其中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂是3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。14.如权利要求12所述的应用，其中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂是3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。15.如权利要求12所述的应用，其中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂是3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)。16.如权利要求1所述的应用，其中，对测试样品中的PIVKA-II的测定包括竞争性免疫检验。17.如权利要求1所述的应用，其中，对测试样品中的PIVKA-II的测定在自动测定装置中进行。18.如权利要求1所述的应用，其中，对测试样品中的PIVKA-II的测定包括夹心免疫检验。19.选自由皂苷、MgCl2和磺基甜菜碱两性离子洗涤剂组成的组的至少一种添加剂在制造用于改善针对PIVKA-II的特异性结合检验的灵敏性的试剂盒中的应用，其中，所述特异性结合检验包括第一反应和第二反应，所述第一反应产生第一复合物，所述第一复合物包含与能够特异性结合PIVKA-II的一抗结合的PIVKA-II，所述第二反应包括使所述第一复合物与二抗接触，所述二抗能够特异性结合PIVKA-II且与可检测标记物缀合，其中所述二抗和有效量的所述至少一种添加剂在稀释液中提供，其中，所述磺基甜菜碱两性离子洗涤剂选自由以下物质组成的组：3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-16(正十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；3-18(正十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐)；ASB-14(酰氨基磺基甜菜碱-14)；和ASB-16(酰氨基磺基甜菜碱-16)。20.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉村徹，千叶陵太郎，吉田荣作，
申请(专利权)人：阿波特日本有限公司，
类型：
国别省市：