狂犬疫苗特异性免疫增强剂的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种狂犬疫苗特异性免疫增强剂的制备方法，它选用猪作免疫动物，将狂犬病疫苗注入猪体内一段时间后，采血样测定其效力单位，然后将猪宰杀，收集脾脏置于低温保存备用。制作时，将脾脏用生理盐水洗干净，将其切碎置于高速组织搅拌机中加等量生理盐水搅拌，然后采用冻融法制备出狂犬疫苗特异性免疫增强剂。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到一种生物药品的制备方法，特别是一种。人类感染狂犬病毒后一旦发病，死亡率则为100%。目前，唯一有效的是注射狂犬病疫苗和抗狂犬病血清，抗狂犬病血清能延长狂犬病发病潜伏期，给疫苗的自动免疫创造条件，但不能完全保护发狂犬病，而狂犬病疫苗也没有100%的保护率。根据有关已接种疫苗后仍然发病的例子进行分析的报导，潜伏期＜30天的占66.2%，免疫后抗体阳性率50%，仍有50%为免疫空白，抗体阴性的接种人群仍潜伏着高度发病的危险性。这类人群可能是与肌体免疫功能失调有关。本专利技术的目的是提供一种新的技术制备狂犬病特异性猪脾转移因子(PSR.V-TF)，用来调节机体免疫功能，配合狂犬病疫苗以促使机体尽早产生抗体，提高抗体阳性率，减少死亡率。本专利技术的技术解决方案是这样的选用猪作免疫动物，将狂犬病疫苗注入猪体内一段时间后，采血样测定其效力单位，当达到10u/ml以上后宰杀，收集脾脏置低温保存备用。制作时，将脾脏用生理盐水清洗干净，将其切碎置于高速组织搅拌机中加等量灭菌生理盐水搅拌，然后采用冻融法制备出狂犬疫苗特异性免疫增强剂。其详细制作过程如下a、猪免疫狂犬病疫苗选择健康猪作免疫动物，猪的重量在50kg左右为最佳，先抽血检测出有先天狂犬抗体及HBsAg等阴性的猪进行免疫狂犬病疫苗，抗原为组织培养人用狂犬病疫苗，免疫程序参照WHO的免疫程序(0、3、7、15、21、30天)，共6针，每针肌注4ml。间隔两个月后加强免疫3针(0、7、14天)，即每针相隔7天，每针4ml。加强免疫20天后采血样，按中国药品生物制品检定所《人用精制抗犬病血清国际单位检定方法》测定效力单位，达到10u/ml以上后宰杀收集脾脏置低温保存备用。b、狂犬疫苗特异性免疫增强剂的制作将收集的脾脏除去脂肪包膜及结缔组织等，用生理盐水洗2～3次，然后将脾脏切碎置于高速组织搅拌机中，加等量灭菌生理盐水搅拌3分钟，取出置于密封容器中，置于-15～-20℃速冻箱中速冻，然后取出在常温下解融，解融后再置于-15～-20℃的速冻箱中速冻，然后又取出在常温下解融，如此反复八次，然后再装入无菌透析袋中，加适量灭菌生理盐水，放置于4℃冰箱内透析24小时，倾出透析液，如此反复透析3次，合并三次透析液，经玻璃滤器过滤除菌后，在无菌的条件下定量灌入经180℃干烤4小时的无菌安瓶内，经低温冷冻干燥后封口。狂犬病特异性猪脾转移因子(即PSR.V-TF)检测结果 PSR.V-TF的临床实验(一)对象与方法1、对象选择107人为实验对象(删除有过敏史、HBsAg阳性、哮喘及免疫功能异常者)，随机分成三组，1、4、7为实验组，2、5、8为对照组Ⅰ，3、6、9为对照组Ⅱ。2、方法实验组应用狂犬病疫苗加PSR.V-TF，对照组Ⅰ用狂犬病疫苗加PS-TF，对照组Ⅱ单用狂犬病疫苗。三组均使用卫生部武汉生物制品所生产的同一批号狂犬疫苗，批号911241-7.25iu，每人份2ml×5支，免疫程序按WHO提出的0、3、7、14、30天各一支，肌注、PSR.V-TF批号920117。PS-TF广州军区南岳制药厂生产，批号900927-5，PSR.V-TF组与PS-TF组、1支/隔日肌注，10支为一疗程。4、狂犬抗体检测方法免疫前均采血作狂犬体检测有无先天及后天狂犬抗体，首针免疫后第15天、30天、45天、150天各采耳垂血0.2ml，用毛细玻璃管吸血分装。狂犬抗体检测采用双盲法进行。酶联免疫吸附检测法。三组狂犬抗体产生的时间阳性率及抗体水平的比较，见表一、表二、表三。表一两组狂犬抗体产生时间、阳性率及抗体水平的比较首针实验组对照组I免疫P值后观察阳性%OD观察阳性%OD天数例数例数例数例数15312580.650.25351440.00.15t=3.51p<0.0130313096.770.40352571.420.24t=4.44p<0.01453131100.00.53353291.420.33t=4.58p<0.01150312167.470.32351542.850.23t=1.96p<0.05表二两组狂犬抗体产生时间、阳性率及抗体水平的比较首针实验组对照组II免疫P值后观察阳性%OD观察阳性%OD天数例数例数例数例数15312580.650.25321237.500.14t=3.84p<0.0130313096.770.40322371.870.24t=4.45p<0.01453131100.00.53322990.620.33t=4.96p<0.01150312167.470.32321340.620.19t=3.3p<0.01表三两对照组抗体产生时间、抗体阳性率及抗体水平的比较首针对照组I对照组II免疫P值后观察阳性%OD观察阳性%OD天数例数例数例数例数15351440.000.15321237.50.14t=0.337p>0.0530352571.420.24322371.870.24t=0.175p>0.0545353291.420.33322990.620.33t=0.227p>0.05150351542.850.2332130.620.19t=1.098p>0.05从表1可见首针免疫后，实验组阳性率为80.65%，对照组Ⅰ阳性率40.00%平均OD值实验组为0.27，对照组Ⅰ只有0.15、t＝3.51 p＜0.01，随着时间延长，30天实验组与对照组Ⅰ阳性率与OD值也随着有上升。两组比较仍有显著性差异，t＝4.44 p＜0.01，两组在45天抗体阳性率达高峰期(100%/91.4%)基本触近，但两组OD值还是有非常显著性差异，t＝4.58 p＜0.01，在150天两组抗体都下降，但实验组阳性率为67.47%，OD值0.32，而对照组Ⅰ阳性率为42.85%，OD值只有0.23，t＝1.96 p＜0.05，仍有显著性差异。从表2看，两组从首针免疫后15天、30天都有显著性差异，45天实验组抗体阳性率达高峰100%，OD值0.53，对照组Ⅱ抗体阳性率达90.62%，OD值0.33，两组阳性率也基本接近，但实验组OD值高出0.2(0.53-0.33) t＝3.3 p＜0.01，从150天两组比较，实验组比对照组阳性率高出26.85%(67.47-40.62)，OD值高出0.13(0.32-0.19)t＝0.33p＜0.01。对照组Ⅰ与对照组Ⅱ均无显著差异，见表三。本次实验观察107人，免疫前狂犬抗体阳性为0，其中剔除了未按全程免疫的及未按时采血作狂犬抗体检测的19人外，实验组31人，对照组Ⅰ35人，对照组Ⅱ32人，共98人。从本次临床免疫效果观察，PSR.V-TF配合狂犬疫苗免疫。(1)、对接种人群能提早了15天以上产生抗体，实验组15天阳性率为80.65%，而对照组Ⅰ与对照组Ⅱ30天，抗体阳性率只有(71.42/71.87)、(80.65-71.42/71.87)。(2)、促进接种人群免疫功能，提高了抗体水平，从表1和表2中看出，实验组比对照组Ⅰ、Ⅱ组OD均有非常显著性差异。(3)、增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种狂犬疫苗特异性免疫增强剂的制备方法，其特征是：ａ、猪免疫狂犬病疫苗，选择健康猪作免疫动物，猪的重量在５０ｋｇ左右为最佳，先抽血检测出有先天狂犬抗体及ＨＢＳＡｇ等阴性的猪进行免疫狂犬病疫苗，抗原为组织培养人用狂犬病疫苗，免疫程序参照Ｗ ＨＯ的免疫程序（０、３、７、１５、２１、３０天），每针肌注４ｍｌ，共６针，间隔两个月后加强免疫３针（０、７、１４天），即每针相隔７天，每针４ｍｌ，加强免疫２０天后采血样，按中国药品生物制品检定所《人用精制抗犬病血清国际单位检定方法》测定效力单位，达到１０↑［μ］／ｍｌ以上后宰杀收集脾脏置低温保存备用；ｂ、狂犬疫苗特异性免疫增强剂的制作，将收集的脾脏除去脂肪包膜及结缔组织等，用生理盐水洗２～３次，然后将脾脏切碎置于高速组织搅拌机中，加等易灭菌生理盐水搅拌３分钟，取出置于密封 容器中，置于－１５～－２０℃速冻箱中速冻，然后取出在常温下解融，解融后再置于－１５～－２０℃的速冻箱中速冻，然后又取出在常温下解融，如此速冻、解融反复８次，然后再装入无菌透析袋中，加适量灭菌生理盐水，放置于４℃冰箱内透析２４小时，倾出透析液，如此反复透析３次，合并３次透析液，经玻璃滤器过滤除菌后，在无菌的条件下灌入经１８０℃干烤４小时的无菌安瓶内，经低温冷冻干燥后封口。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈荣祥，陈传良，袁少东，文美华，汪联荣，谭云球，
申请(专利权)人：衡山县卫生防疫站，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]