用于抗体纯化的载体、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术的目的是提供其上固定有蛋白A的载体及所述载体的制备方法，所述蛋白A具有允许抗体在其中许多抗体不必经受酸修饰的温和pH条件(具体地，pH4.0至5.5)下解吸的特定氨基酸序列；及所述载体的制备方法。一种固定化载体(不包括具有整体结构的固定化载体)，其上通过静电相互作用吸附有蛋白，所述蛋白由通过通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成，其中由R1-R2-R3表示的部分被用于固定至固定化载体上，其中：该序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的序列；R2部分的序列是作为待被固定的蛋白的蛋白A突变体的序列，或其中蛋白A突变体的序列的1至3个单位被连接在一起的序列，所述蛋白A突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的抗体解离的特性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于抗体纯化的载体、其制备方法及其应用
本专利技术涉及用于抗体纯化的载体及其制备方法。本专利技术进一步涉及以用于抗体纯化的载体填充的亲和色谱柱，以及用于使用该柱纯化抗体的方法。
技术介绍
近年来，对基于抗体的具有有限副作用的抗体药物的需求逐年增加。使用其上固定有蛋白A(ProteinA)的载体的亲和色谱法被广泛用作用于纯化抗体的方法。此处所用的蛋白A是指源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的蛋白A(在A.Forsgren和J.Sjoquist,J.Immunol.(1966)97,822-827中被描述)或能表现出与抗体结合的功能的构成该蛋白的结构域序列的一部分。用于利用亲和色谱法纯化抗体的典型方法如下，所述亲和色谱法使用其上固定有蛋白A的载体。即，该方法包括(1)使含有抗体的原材料粗溶液经过以其上固定有蛋白A的载体填充的柱，以使期望的抗体吸附至载体，(2)用中性缓冲溶液洗涤抗体吸附至其的载体，以去除杂质，以及然后(3)使用酸性缓冲溶液(具体地，pH2.5至3.0)洗脱吸附至载体的抗体。本专利技术人开发了一种技术作为用于通过提高每载体与抗体结合的容量(capacity)有效纯化抗体的手段，包括通过控制定向(orientation)将源自蛋白A的蛋白作为与抗体的Fc结构域特异性结合同时控制定向的蛋白引入不溶性载体(参见专利文献1至16)。当以更一般化的形式表述时，本专利技术人开发的定向控制的(orientation-controlled)固定方法如下。该方法是一种定向控制的固定方法，包括使用由通过通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6(其中所述序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的序列；R1部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列；R2部分的序列是待被固定的源自蛋白A的蛋白的序列，及被改造为不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列，从而它可保持与抗体结合的特性；R3部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列(spacersequence)；R4部分的序列是包含由半胱氨酸-X(其中X表示赖氨酸或除半胱氨酸之外的氨基酸残基)表示的2个氨基酸残基的序列；R5部分的序列可不存在，且如果存在，是不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列，以及包含能够使得由通过通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列；且R6部分的序列是用于纯化蛋白的亲和标签序列)表示的氨基酸序列组成的蛋白以氰化(cyanate)在R4部分唯一存在的半胱氨酸残基的SH基团，以及使半胱氨酸氰化的(cyanocysteinated)蛋白与引入氨基作为官能团的不溶性载体反应，以通过在其羧基端和载体的氨基端之间酰胺键合来固定由R1-R2-R3表示的部分。此外，迄今为止，在使用由本专利技术人开发的通过蛋白A的定向控制固定的载体的抗体纯化中，已经应用包括以下的纯化手段：(1)使含有抗体的原材料粗溶液经过以其上固定有蛋白A的载体填充的柱，以使期望的抗体吸附至载体，(2)用中性缓冲溶液洗涤抗体吸附至其的载体，以去除杂质，以及(3)使用酸性缓冲溶液(具体地，pH2.5至3.0)洗脱吸附至载体的抗体，提供用于通过提高的每载体与抗体结合的容量有效纯化抗体的手段。然而，包括使用具有2.5至3.0的pH的酸性缓冲溶液洗脱抗体的上述方法具有严重的缺陷。具体地，存在以下问题：抗体与强酸(例如，pH3.0或更小)缓冲溶液的接触导致抗体的酸修饰并改变抗体的高级结构，导致诱导聚集以及作为药物的抗体的活性的损失。为了解决该问题，试图开发更稳定的抗体分子；然而，明显的是，这样的解决方案不可能是针对伴随通过使用其上固定有蛋白A的载体的亲和色谱法纯化的问题的常规解决方案，且对能够广泛应用于许多抗体分子的制备的方法的开发存在需求。引用列表专利文献专利文献1：日本专利公开(Kokai)号2011-132140A专利文献2：日本专利公开(Kokai)号2011-132145A专利文献3：日本专利公开(Kokai)号2011-132141A专利文献4：日本专利号2990271专利文献5：日本专利号3047020专利文献6：日本专利号3740529专利文献7：日本专利公开(Kokai)号2005-112827A专利文献8：日本专利号4528951专利文献9：日本专利公开(Kokai)号2008-115151A专利文献10：日本专利公开(Kokai)号2008-115152A专利文献11：日本专利公开(Kokai)号2008-115153A专利文献12：日本专利公开(Kokai)号2008-266219A专利文献13：日本专利公开(Kokai)号2008-266221A专利文献14：日本专利公开(Kokai)号2009-156767A专利文献15：日本专利公开(Kokai)号2010-127856A专利文献16：日本专利号40006523专利技术概述技术问题为了提供针对上述伴随通过使用其上固定有包含蛋白A的蛋白的载体的亲和色谱法的纯化的问题的常规解决方案，本专利技术提供了其上固定有蛋白A的载体及其制备方法，所述蛋白A具有允许抗体在其中许多抗体不经受酸修饰的温和pH条件(具体地，pH4.0至5.5)下解吸的特定氨基酸序列。另外，本专利技术提供了用于抗体纯化的亲和色谱柱及使用该柱纯化抗体的方法，所述亲和色谱柱以其上固定有包含蛋白A的蛋白的载体填充。问题的解决方案本专利技术人已进行了关于解决上述在蛋白A的固定中待消除的问题的深入研究。本专利技术人已经获得一个想法，如果蛋白A突变体可被开发作为在包含由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列的序列部分中负责与抗体结合的R2部分中使用的蛋白A，可解决上述问题，所述由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列用于蛋白的定向控制的固定，蛋白A突变体具有以下特性：在抗体纯化期间，在使含有抗体的原材料粗溶液经过以蛋白A固定的载体填充的柱并使期望的抗体吸附至载体、随后洗脱的步骤中，其在洗脱吸附至载体的抗体中通过使用酸性缓冲溶液允许抗体在作为温和pH条件的pH4.0至5.5的范围内解吸，而不影响用中性缓冲溶液洗涤抗体吸附至其的载体以去除杂质的操作。在完成本专利技术之前的时间点，本专利技术人发现蛋白A表现出与抗体强烈的结合反应，该蛋白A通过用精氨酸或甘氨酸取代源自蛋白A的A-结构域的序列中所有赖氨酸残基被改造为在R2部分不包含赖氨酸或半胱氨酸，所述源自蛋白A的A结构域的序列通过SEQIDNO:1表示(日本专利公开(Kokai)号2011-132140A、2011-132145A、和2011-132141A)。因此，制备了由被改造为上述通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6的序列组成的蛋白，其包含蛋白A的氨基酸序列(该蛋白被称作AD-1.SEQIDNO:2)，并基于该序列进行另外详尽的单个氨基酸取代，以制备AD-1的约800个突变体。如果能够遵循如由本专利技术人开发的用于改良蛋白的方法(日本专利No.4534030、日本国内再公开号01/000797、M.Iwakura等J.Biol.Chem.281，13234-13246本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化载体，所述固定化载体不包括具有整体结构的固定化载体，蛋白通过静电相互作用吸附在所述固定化载体上，所述蛋白由通过通式：R1‑R2‑R3‑R4‑R5‑R6表示的氨基酸序列组成，其中由R1‑R2‑R3表示的部分被用于固定在所述固定化载体上，其中：所述序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的序列；R1部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列；R2部分的序列是作为待被固定的蛋白的蛋白A突变体的序列或其中蛋白A突变体的序列的1至3个单位被连接在一起的序列，以及是不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的序列，所述蛋白A突变体具有在中性条件下与抗体强烈结合并在pH 4.0至5.5的弱酸性条件下与在中性条件下结合的所述抗体解离的特性；R3部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列；R4部分的序列是包含由半胱氨酸‑X表示的2个氨基酸残基的序列，其中X表示丙氨酸或除丙氨酸和半胱氨酸之外的氨基酸残基；R5部分的序列可不存在，且如果存在，是不包含赖氨酸和半胱氨酸残基的序列，以及是包含能够使得由通过通式：R1‑R2‑R3‑R4‑R5‑R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列；且R6部分的序列是用于蛋白纯化的亲和标签序列。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.14 JP 2012-1349051.一种固定化载体，所述固定化载体不具有整体结构，蛋白通过静电相互作用吸附在所述固定化载体上，所述整体结构是指具有从顶面至底面贯穿延伸的大孔的多孔体，所述多孔体的特征在于在所述大孔里面具有微孔，并且所述多孔体具有1至100μm的大孔和0至100nm的微孔，所述蛋白由通过通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成，其中由R1-R2-R3表示的部分被用于固定在所述固定化载体上，其中：所述序列表示从氨基末端侧到羧基末端侧的序列；R1部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的序列；R2部分的序列是由SEQIDNO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列，或其中由SEQIDNO:4至7的任何序列组成的蛋白A的A-结构域的突变体蛋白的序列的1至3个单位被连接在一起的序列；R3部分的序列可不存在，且如果存在，是包含除赖氨酸和半胱氨酸残基之外的氨基酸残基的间隔序列；R4部分的序列是包含由半胱氨酸-X表示的2个氨基酸残基的序列，其中X表示丙氨酸或除丙氨酸和半胱氨酸之外的氨基酸残基；R5部分的序列可不存在，且如果存在，是不包含赖氨酸和半胱氨酸残基的序列，以及是包含能够使得由通过通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列组成的整个蛋白的等电点在酸性侧的酸性氨基酸残基的序列；且R6部分的序列是用于蛋白纯化的亲和标签序列。2.根据权利要求1所述的固定化载体，其中所述蛋白A的A-结构域的突变体蛋白是以下蛋白A的A-结构域的突变体蛋白：当抗体与固定在阵列基板上的所述蛋白A的A-结构域的突变体蛋白结合并用pH5.0的0.1M的柠檬酸钠溶液洗脱时，其直到一半量的结合的所述抗体解离时经过的时间(T0.5)和其与所述抗体的解离常数，与由SEQIDNO:3表示的蛋白A突变体的T0.5和解离常数相比是减小的。3.根据权利要求1所述的固定化载体，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R3部分的序列是由1至10个甘氨酸残基组成的序列。4.根据权利要求1所述的固定化载体，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R5部分的序列是由天冬氨酸和/或谷氨酸的氨基酸残基组成的1至10个氨基酸残基的序列。5.根据权利要求4所述的固定化载体，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R5部分的序列是由1至10个天冬氨酸残基组成的序列。6.根据权利要求1所述的固定化载体，其中由通式：R1-R2-R3-R4-R5-R6表示的氨基酸序列中所述R6部分的序列是由4个或更多个组氨酸残基组成的序列。7.根据权利要求1所述的固定化载体，其中所述蛋白被固定在载体上以成为固定化载体，其中所述载体选自由以下组成的组：二氧化硅载体、玻璃珠和聚合物。8.一种用于制备根据权利要求1所述的固定化载体的方法，包括通过静电相互作用将由通过通式：R1-R2-R3-R4...

【专利技术属性】
技术研发人员：岩仓正宽，广田洁宪，大高诚治，
申请(专利权)人：大曹株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP