一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，具体为：构建含有目的基因的重组穿梭质粒，然后加入含有MgCl2的活化的鸭疫里默氏杆菌菌液中，37℃孵育30分钟，然后加入含MgCl2的GCB培养基孵育7小时，涂布在含对应抗性固体GCB培养基上，37℃培养箱培养18‑24h至单克隆长出，即获得鸭疫里默氏杆菌回补菌株；本发明专利技术的方法简单，载体重组后不需要转入供体菌，直接可进入宿主菌并发挥相关基因功能；并且培养周期短，一般情况下18小时就能分离到回补株克隆；成本低，为鸭疫里默氏杆菌基因功能验证提供了工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法。
技术介绍
目前主要通过敲除鸭疫里默氏杆菌的基因来研究该基因的功能，进而研究鸭疫里默氏杆菌的致病机理。将细菌某个基因敲除后通常会引起它的表型发生改变，但有些表型变化可能是由于被敲除的基因影响了其它基因的转录表达所导致。因此，我们在敲除某个基因时，还需要对这个基因进行回补，来确定该基因的功能。对于像大肠杆菌等细菌可以通过氯化钙转化法直接将重组质粒导入细菌细胞内。但鸭疫里默氏杆菌要求比较严格，目前主要通过结合转移的方法导入重组质粒。这种方法需要利用大肠杆菌作为供体菌，且步骤繁琐、耗时过长等给鸭疫里默氏杆菌研究带来诸多不便。基于此技术背景，因此急需一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，该方法简单，周期短。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，构建含有目的基因的重组穿梭质粒，然后加入含有MgCl2的活化的鸭疫里默氏杆菌菌液中，37℃孵育30分钟，然后加入含MgCl2的GCB培养基孵育7小时，然后涂布在含对应抗性固体GCB培养基上，37℃培养箱培养18-24h至单克隆长出，即获得鸭疫里默氏杆菌回补菌株；所述穿梭质粒为能够在鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌中稳定存在的质粒。本专利技术中，所述穿梭质粒为含有鸭疫里默氏杆菌复制起始基因的质粒。进一步，所述穿梭质粒为pLMF03，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术中，所述MgCl2的浓度为5mM。本专利技术中，活化鸭疫里默氏杆菌的方法如下：从-80℃取出鸭疫里默氏杆菌在血平板上复苏至菌落长出，用接种环挑取单克隆菌落接种至GCB液体培养基中培养过夜；调整OD600＝1，得活化鸭疫里默氏杆菌。本专利技术中，所述目的基因为鸭疫里默氏杆菌RA0C_1193基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术中，所述重组穿梭质粒由以下方法制备：将SEQIDNO.4所示序列经NcoI和XbaI酶切位点连入pLMF03质粒NcoI和XbaI酶切位点制得。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，该方法载体重组后不需要转入供体菌，直接可以进入宿主菌并发挥相关基因功能；并且培养周期短，一般情况下18小时就能分离到回补候选株克隆；所需成本较低，为研究鸭疫里默氏杆菌基因功能提供了有力的工具。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为穿梭质粒pLMF03图谱。图2为PCR鉴定穿梭质粒pLMF03转入ATCC11845后长出来的转化子的电泳图(第1-9泳道为随机选取的9个转化子，质粒pLMF03为阳性对照，ATCC11845野生株为阴性对照；)图3为PCR扩增出的RA0C-1193基因片段的电泳图(第1泳道DNAmarker；第二泳道RA0C-1193基因片段)。图4为用限制性内切酶NcoI和XbaI酶切质粒pLMF03和RA0C-1193基因片段，回收酶切产物的电泳图(第1泳道为酶切后的质粒pLMF03，第2泳道为酶切后的RA0C-1193基因片段)。图5为载体pLMF03与目的基因RA0C-1193连接后转入DH5α长出来的转化子的鉴定电泳图(第1-6泳道为随机挑取的6个转化子，7泳道为阳性对照；ATCC11845野生株为阳性对照)。图6为重组质粒酶切后的电泳图。图7为自然转移长出来的转化子鉴定的电泳图(1-5为转化子为模板；6为质粒pLMF03为模板；7为鸭疫里默氏杆菌ATCC11845为模板)。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例1穿梭质粒的准备：首先从-80℃取出带有穿梭质粒pLMF03(图1，SEQIDNO.7)的宿主菌DH5α(本实验室保存)在LB平板上，待其生长起来后，用接种环挑取单克隆菌落接种至4ml液体LB培养基中培养过夜；然后用质粒小提试剂盒(购自天根)对过夜培养的菌液进行质粒的提取，并测浓度。受体菌的制备：首先从-80℃取出鸭疫里默氏杆菌ATCC11845野生株(本实验室保存)在血平板上复苏，待其生长起来后，用接种环挑取单克隆菌落接种至10ml液体GCB培养基培养过夜；将其调整为OD600＝1，并加入5mMMgCl2混匀备用。自然转移：取两个1.5ml无菌离心管，一个作为实验组，一个作为对照组，分别加入300μl(含5mMMgCl2)上述菌液，其中实验组分别加入1μg的穿梭质粒pLMF03，对照组不加。封口胶密封并置于37℃培养箱孵育30分钟；取出孵育30分钟的实验组和对照组，分别向其中加入700μl含有5mMMgCl2的GCB培养基，即定容至1ml，封口胶密封，37℃培养箱孵育7小时。培养基的制备：4个含头孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)抗性的GCB固体培养基。从实验组和对照组分别取出100μl菌液，分别用一次性涂布棒涂在含头孢西丁(1μg/ml)(Cefoxitin，CFX)的GCB固体培养基上，将培养基置于37℃培养箱培养18h至单克隆长出。阳性结合子的筛选及鉴定：经观察发现，在含头孢西丁抗性的培养基上，实验组长出了明显的单克隆菌落，而对照组没有，挑取9个单克隆分离在新的含头孢西丁抗性的GCB固体培养基上，37℃培养箱培养过夜。将挑取的单克隆进行PCR扩增cfxA部分片段(SEQIDNO.1)，PCR鉴定引物如下：cfxp1：5’-ggtgctgcaatgttgatg-3’(SEQIDNO.2)；cfxp2：5’-ccgctaaggtataactg-3’(SEQIDNO.3)；PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；再72℃后延伸8min；16℃保存；同时以质粒pLMF03为阳性对照，ATCC11845野生株为阴性对照，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。结果显示，穿梭质粒pLMF03能够成功导入鸭疫里默氏杆菌ATCC11845野生株。实施例2、回补鸭疫里默氏杆菌RAATCCΔRA0C-1193构建重组质粒：在NCBI上查找RAATCC11845株的RA0C-1193基因(约861bp)，序列如SEQIDNO.4所示：然后设计扩增目的基因的引物，具体引物如下：p1：5’-catgccatggatgagccaaaccataaatac-3’(SEQIDNO.5)，下划线表示NcoI；p2：5’-ctagtctagattagaaagtgattttgtaagtgcctg-3’(SEQIDNO.6)下划线表示XbaI；然后以鸭疫里默氏杆菌ATCC11845基因组为模板，p1和p2为引物扩增目的基因片段，PCR扩增程序如下：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；再72℃后延伸10min；最后16℃保存；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。结果显示，扩增获得约861bp大小条带，PCR产物大小与预期大小相符。用限制性内切酶NcoI和XbaI酶切质粒pLMF03和目的基因片段，回收酶切产物，酶切产物进行琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，其特征在于：构建含有目的基因的重组穿梭质粒，并将重组穿梭质粒加入含有MgCl2的活化的鸭疫里默氏杆菌菌液中，37℃孵育30分钟后，加入含MgCl2的GCB培养基继续孵育7小时，最后涂布在含对应抗性固体GCB培养基上，37℃培养箱培养18‑24h至单克隆长出，即获得鸭疫里默氏杆菌回补候选菌株；所述穿梭质粒为能够在鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌中稳定存在的质粒。

【技术特征摘要】
1.一种快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，其特征在于：构建含有目的基因的重组穿梭质粒，并将重组穿梭质粒加入含有MgCl2的活化的鸭疫里默氏杆菌菌液中，37℃孵育30分钟后，加入含MgCl2的GCB培养基继续孵育7小时，最后涂布在含对应抗性固体GCB培养基上，37℃培养箱培养18-24h至单克隆长出，即获得鸭疫里默氏杆菌回补候选菌株；所述穿梭质粒为能够在鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌中稳定存在的质粒。2.根据权利要求1所述快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，其特征在于：所述穿梭质粒为含有鸭疫里默氏杆菌复制起始基因的质粒。3.根据权利要求1所述快速回补鸭疫里默氏杆菌缺失基因的方法，其特征在于：所述穿梭质粒为穿梭质粒pLMF03，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。4.根据权利要求1所述快速回补...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘马峰，张利，黄月，程安春，汪铭书，贾仁勇，朱德康，陈舜，孙昆峰，杨乔，吴英，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51