一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法技术

本发明专利技术公开了一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因

【技术实现步骤摘要】
一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法
本专利技术涉及生物
的基因编辑技术，确切地说是一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法。
技术介绍
维吉尼亚链霉菌IBL14(StreptomycesvirginiaeIBL14)是我们从甾体药物生产厂家附近的污泥中分离筛选到的一株放线菌，它能够有效的转化和降解孕酮，黄酮，皮质醇和胆固醇等多种甾体类化合物_ENREF_1（Wang,F.-Q.;Zhang,C.-G.;Li,B.;Wei,D.-Z.;Tong,W.-Y.,NewmicrobiologicaltransformationsofsteroidsbyStreptomycesvirginiaeIBL-14.Environmentalscience&technology2009,43(15),5967-5974）。CRISPR（clusteredregμlarlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）称为成簇规则间隔的短回文重复序列，最先于20世纪八十年代发现于大肠杆菌中_ENREF_1（Ishino,Y.;Shinagawa,H.;Makino,K.;Amemura,M.;Nakata,A.,NucleotideSequenceoftheiapGene,ResponsibleforAlkalinePhosphataseIsozymeConversioninEscherichiacoli,andIdentificationoftheGeneProduct.JOURNALOFBACTERIOLOGY1987,169(12),5429-5433）。2002年R．Jansen等详细比较分析了原核生物基因组中的这种成簇规则间隔的短回文重复序列，发现了该重复序列的旁侧经常伴随出现保守的基因序列_ENREF_1（Jansen,R.;Embden,J.D.;Gaastra,W.;Schouls,L.M.,IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes.MolMicrobiol2002,43(6),1565-75），他们将这种独特的重复序列命名为CRISPR，保守基因序列编码的蛋白质称为Cas附属蛋白(CRISPR-associatedproteins)。目前已发现CRISPR-Cas系统广泛分布于原核生物中_ENREF_1（http://crispr.u-psud.fr/），已商业应用于基因编辑的仅为CRISPR-CasII型系统中的Cas9蛋白。迄今为止，CRISPR-CasI型系统虽有诸多发现，但未见可应用于基因编辑的报道。先前，我们应用维吉尼亚链霉菌IBL14中的typeI-B-sv14型CRISPR-Cas系统结合一个工程的基因编辑质粒可对维吉尼亚链霉菌IBL14自身染色体进行基因编辑_ENREF_1（童望宇;雍德祥;李雪;邱彩花一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法.2015110028173,2015），但未能实现对其它生物基因组进行基因编辑。本专利技术将维吉尼亚链霉菌IBL14typeI-B-sv14型CRISPR-Cas系统中的基因cas7-5-3与质粒（plasmid）连接得到一个Cas7-5-3蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3，结合设计的基因编辑质粒（plasmid-t/gDNA）或其它质粒首次实现了在原核生物大肠杆菌与枯草杆菌中的基因编辑。且该Cas7-5-3蛋白（含1323个氨基酸）具有与Cas9蛋白（含1368个氨基酸）相近的分子大小。虽已发现大肠杆菌中存在有CRISPR-CasI型系统_ENREF_1（Semenova,E.;Savitskaya,E.;Musharova,O.;Strotskaya,A.;Vorontsova,D.;Datsenko,K.A.;Logacheva,M.D.;Severinov,K.,HighlyefficientprimedspaceracquisitionfromtargetsdestroyedbytheEscherichiacolitypeI-ECRISPR-Casinterferingcomplex.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2016,113(27),7626-7631），但迄今尚未见有通过大肠杆菌中的CRISPR-CasI型系统进行基因编辑的报道；特别是枯草杆菌中尚未发现有CRISPR-Cas系统_ENREF_1（http://crispr.u-psud.fr/）。本专利技术通过敲除大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因lacZ和枯草杆菌乳酸脱氢酶基因ldh，从而实现验证该质粒体系的功效之目的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种类似于CRISPR-CasII型系统中Cas9蛋白的CRISPR-CastypeI-B-sv14系统Cas7-5-3蛋白表达质粒体系，结合基因编辑质粒或其它质粒进行原核生物的基因编辑。为达此目的，本专利技术解决其问题所采用的技术方案是：一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：维吉尼亚链霉菌IBL14中含有3个基因cas7-5-3，其核酸序列如附表1所描述，经蛋白表达质粒构建（附图1）、基因编辑质粒构建（附图2）和重组子的获取与检验步骤(附图3)可有效的对原核生物基因组进行编辑。所述的一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：包括的蛋白表达质粒构建、基因编辑质粒构建和重组子的获取与检验步骤如下：（1）根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3及相关信息序列设计引物（附表2），以维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模版，用DNA聚合酶通过PCR反应扩增得到cas7-5-3基因，并连接到质粒（plasmid）上，得Cas7-5-3蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3；（2）根据原核生物靶向基因DNA序列信息设计引物（附表2），以原核生物基因组为模版，通过PCR反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别和切割位点以及overlapPCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段，并用overlapPCR将上下同源臂连接得基因编辑模版(templateDNA/t-DNA)，同时根据原核生物靶向基因序列信息设计并直接合成首尾分别包含乳糖操纵子启动子和RNA终止子的靶向基因片段(guide-DNA/g-DNA)（附表2），并根据限制性酶切位点上的粘性末端将基因编辑模版与靶向基因片段连接到质粒上得到基因编辑质粒(plasmid-t/gDNA)；（3）制备原核生物细胞感受态，并将按步骤（1）得到的蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3和按步骤（2）得到的各种靶向基因编辑质粒分别转化到目标菌感受态中得到不同的基因编辑后的重组子；对重组子染色体进行PCR和基因测序和/或功能分析，以确证编辑后的目的重组子。所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因

【技术特征摘要】
1.一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：维吉尼亚链霉菌IBL14中含有3个基因cas7-5-3，经蛋白表达质粒构建、基因编辑质粒构建和重组子的获取与检验步骤可对原核生物基因组进行编辑。2.根据权利要求1所述的一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3的基因编辑方法，其特征在于：步骤如下：（1）根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3及相关信息序列设计引物，以维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模版，用DNA聚合酶通过PCR反应扩增得到cas7-5-3基因，并连接到质粒plasmid上，得Cas7-5-3蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3；（2）根据原核生物靶向基因DNA序列信息设计引物，以原核生物基因组为模版，通过PCR反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别和切割位点以及overlapPCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段，并用overlapPCR将上下同源臂连接得基因编辑模版templateDNA/t-DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：童望宇，邱彩花，杨兴旺，王安静，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34