一种以游离的甘氨酸和L-半胱氨酸为药理活性基团的合成肽制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种合成肽及其在制备治疗脑损伤药物中的用途。该合成肽的氨基酸序列为X1‑(Gly‑L‑Cys)n‑L‑Ala‑X2‑X3（I），式中，X1是无或L‑Phe，X2是无或L‑Cys，X3是无或L‑Phe，X1、X3不能同时为无，n≤8。动物实验表明该类合成肽能在极低的剂量下通过静脉给药方式，透过血脑屏障，到达大脑，在脑内蛋白水解酶的作用下水解生成游离的甘氨酸和半胱氨酸发挥神经保护作用，减少脑的缺血灌注损伤，起到治疗脑卒中的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及合成肽及其在制备治疗脑损伤药物中的用途。
技术介绍
甘氨酸是化学结构最简单的氨基酸，但具有复杂的功能。甘氨酸在中枢神经系统中是一种重要的抑制性神经递质，在控制神经元兴奋性方面发挥重要作用。动物实验发现甘氨酸具有明显的神经保护作用，并且在一些临床试验中也发现甘氨酸可明显改善认知功能障碍和痴呆，尤其是可以作为一个常规的精神安定剂治疗精神分裂症。除此之外，甘氨酸还可以治疗心脏损伤和脑卒中。L-半胱氨酸是一种神经调节物质，也是一种具有神经保护作用的抗氧化剂。同时，它也是脑内谷胱甘肽的重要合成单位，合成的谷胱甘肽对于脑缺血再灌注损伤和帕金森病都有明显的治疗作用。L-苯丙氨酸是人体必需氨基酸之一，属芳香族氨基酸。已有研究表明，L-苯丙氨酸可作为抗癌药物的载体将药物分子直接导入癌瘤区，其效果是其他氨基酸的3～5倍。尽管甘氨酸和半胱氨酸都有明显的脑保护作用，但是外周给甘氨酸(800mg/kg)和半胱氨酸(500mg/kg)剂量过大，导致副反应严重，限制了它们的临床应用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供了一类新的合成肽，它是由甘氨酸，半胱氨酸，丙氨酸和苯丙氨酸四种天然氨基酸为原料脱水缩合而成，在生物学 上是有活性的，在诊断学上是有用的并具有治疗脑损伤的作用。这些肽类特别稳定并易透过血脑屏障，因此通过静脉途径给药仍是有效的。本专利技术的第一方面，提供了一种合成肽，其结构特征，自N端至C端如下式I：X1-(Gly-L-Cys)n-L-Ala-X2-X3(I)，式中，X1是无或L-PheX2是无或L-CysX3是无或L-PheX1、X3不能同时为无，n≤8，n为Gly-L-Cys的排列在序列中的重复次数，该类合成肽中存在三种蛋白水解酶切割位点，一个是Gly与L-Cys的连接点,一个是L-Cys与L-Ala的连接点，一个是肽两端L-Phe与式I中其它任意氨基酸的连接点，蛋白水解酶切割后产生游离Gly和L-Cys作为药物或药理活性基团，L-Ala是疏水性氨基酸，促进合成肽穿透细胞膜，L-Phe作为穿透细胞膜的载体，可携带合成肽分子穿过血脑屏障，进入大脑。甘氨酸：Gly，G；L-半胱氨酸：L-Cys，C；L-苯丙氨酸：L-Phe，F；L-丙氨酸：L-Ala，A。本专利技术中提到的Cys、Phe、Ala都是L型的。在另一优选例中，合成肽可以选自以下任意一种：(a)NH2-Gly-L-Cys-L-Ala-L-Phe-COOH；(b)NH2-Gly-L-Cys-L-Ala-L-Cys-L-Phe-COOH；(c)NH2-L-Phe-Gly-L-Cys-L-Ala-L-Cys-L-Phe-COOH；(d)NH2-(Gly-L-Cys)4-L-Ala-L-Phe-COOH；(e)NH2-(Gly-L-Cys)8-L-Ala-L-Phe-COOH；(f)NH2-L-Phe-Gly-L-Cys-L-Ala-COOH；(g)NH2-L-Phe-Gly-L-Cys-L-Ala-L-Cys-COOH；(h)NH2-L-Phe-(Gly-L-Cys)4-L-Ala-L-Cys-COOH；本专利技术的另一方面是提供该类合成肽在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。优选地，提供该类合成肽在制备治疗缺血性脑卒中，出血性脑卒中，脑创伤，阿尔茨海默病，帕金森病及其他神经退行性疾病药物中的应用。所述药物为注射剂。优选地，该类合成肽用于治疗神经系统疾病时采用静脉注射的方式给药。本专利技术在具体实施例中提供通过固相合成制备本专利技术各类合成肽的方法。为了确定本专利其它合成肽是否也有脑保护作用，我们建立了皮层神经元离体糖氧剥夺(OGD)模型，神经元在OGD损伤情况下，用500μM的各合成肽处理神经元，用cck8去评价细胞的活力，从而判断各合成肽对神经元有无保护作用。由图2可见，各合成肽均有保护作用，其中GCAF,(GC)4AF,GCACF,(GC)4ACF,FGCAC合成肽对损伤神经元具有明显保护作用。本专利技术用SD大鼠作为实验对象，采用脑中动脉阻断法(MCAo)制备脑缺血大鼠模型，缺血3小时后静脉注射药物，1小时后取脑，脑组织冰冻切片，在荧光显微镜下观察脑片中荧光物质强度。采用静脉注射FITC(异硫氰酸荧光素,紫外激发可发绿色荧光；8μmol/kg)标记大鼠脑神经细胞，结果可见未缺血大鼠脑组织中未见荧光标记的神经细胞；缺血大鼠脑组织中镜下可见极少量FITC标记的绿色荧光神经细胞；脑缺血后注 射FITC-GC，镜下也只观察到极少量荧光细胞；脑缺血后注射FITC-GCF和FITC-GCAF(8μmol/kg),镜下可见大量荧光标记的神经细胞，并且后者比前者镜下观察到的荧光细胞数量更多，荧光信号更强(见附图3)，表明Phe作为穿透细胞膜的载体，可携带GC穿透血脑屏障，进入大脑，并且Ala作为疏水性氨基酸，在大鼠缺血情况下，通过静脉注射方式，进一步增加GCF透过血脑屏障的能力，使GCAF更高效的进入大脑。为了说明GCAF通过静脉注射方式透过血脑屏障进入大脑后，被蛋白水解酶水解为Gly和L-Cys，，使脑内的Gly和L-Cys的水平上升，我们建立大鼠脑缺血模型，后随即分为两组，一组为对照组，缺血5h后静脉注射生理盐水；另一组为实验组，静脉注射12mg/kg GCAF,24h后取脑，用HPLC测定大鼠脑缺血损伤区Gly和L-Cys的含量。结果表明大鼠脑缺血后，静脉给GCAF组，大鼠脑缺血区Gly和Cys的含量均高于缺血后给生理盐水组，说明静脉给缺血大鼠GCAF后，GCAF透过血脑屏障，进入大脑，水解生成Gly和L-Cys。(见附图4)本专利技术用SD大鼠作为实验对象，静脉注射给予GCAF(12mg/kg)、依达拉奉(临床脑卒中治疗药物；6mg/kg)，采用MCAo脑缺血大鼠模型，缺血后5h，静脉一次性注射上述药物。24h后，处死动物，取脑，后TTC染色，梗死体积用([(VC－VL)/V C]表示,VC是对照半球体积，,VL是损伤半球非梗死体积)。结果可见,注射生理盐水的脑缺血大鼠，梗死体积0.362±0.034；给予12mg/kg GCAF，梗死体积0.043±0.02；注射6mg/kg依达拉奉，梗死体积为0.163±0.006；相对于静脉给生理盐水和依达拉奉组，给GCAF四肽药组有更低的梗死体积，并且有统计学意义(p<0.05)(见表2，附图5)。总之，本专利技术有如下优点：(1)本专利技术提供的合成肽可以通过静脉注射，以L-Phe为穿透细胞膜的载体，L-Ala是疏水性氨基酸，促进合成肽穿透细胞膜，透过血脑屏障，进入大脑，在脑内蛋白水解酶的作用下水解生成游离的甘氨酸和半胱氨酸发挥神经保护作用，减少脑的缺血灌注损伤，起到治疗脑卒中的目的。此外，甘氨酸除可用于脑卒中治疗外，还可明显改善认知功能障碍和痴呆，尤其是可以作为一个常规的精神安定剂治疗精神分裂症。而L-半胱氨酸以及以它为基础合成的谷胱甘肽作为一种强抗氧化剂，能明显改善帕金森病患者的氧化应激损伤和脑缺血再灌注损伤。(2)副作用小：本专利技术只需要12mg/kg的GCAF静脉注射剂量，即可达到显著的治疗效果。(3)安全：该合成肽的氨基酸残基取自20种组成人体蛋白质的氨基酸，安全本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成肽，其特征在于，其结构特征，自N端至C端如下式I：X1‑(Gly‑L‑Cys)n‑L‑Ala‑X2‑X3（I），式中，X1是无或L‑Phe，X2是无或L‑Cys，X3是无或L‑Phe，X1、X3不能同时为无，n≤8，n为Gly‑L‑Cys的排列在序列中的重复次数，该类合成肽中存在三种蛋白水解酶切割位点，一个是Gly与L‑Cys的连接点,一个是L‑Cys与L‑Ala的连接点，一个是肽两端L‑Phe与式I中其它任意氨基酸的连接点，蛋白水解酶切割后产生游离Gly和L‑Cys作为药物或药理活性基团，L‑Ala是疏水性氨基酸，促进合成肽穿透细胞膜，L‑Phe作为穿透细胞膜的载体，可携带合成肽分子穿过血脑屏障，进入大脑。

【技术特征摘要】
1.一种合成肽，其特征在于，其结构特征，自N端至C端如下式I：X1-(Gly-L-Cys)n-L-Ala-X2-X3（I），式中，X1是无或L-Phe，X2是无或L-Cys，X3是无或L-Phe，X1、X3不能同时为无，n≤8，n为Gly-L-Cys的排列在序列中的重复次数，该类合成肽中存在三种蛋白水解酶切割位点，一个是Gly与L-Cys的连接点,一个是L-Cys与L-Ala的连接点，一个是肽两端L-Phe与式I中其它任意氨基酸的连接点，蛋白水解酶切割后产生游离Gly和L-Cys作为药物或药理活性基团，L-Ala是疏水性氨基酸，促进合成肽穿透细胞膜，L-Phe作为穿透细胞膜的载体，可携带合成肽分子穿过血脑屏障，进入大脑。2.根据权利要求1所述的合成肽，其特征在于，其化学式，可以选自以下任意一种：（a）NH2-Gly-L-Cys-L-Ala-L-Phe-COOH；（b）NH2-Gly-L-Cys-L-Ala-L-Cys-L-Ph...

【专利技术属性】
技术研发人员：万芪，陈娟，庄杨，张娅，万沙，
申请(专利权)人：武汉弘跃医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42