甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽及其在脑卒中药物制备中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种新的物质甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒中药物中的用途，属于医药领域。动物实验表明上述三肽通过静脉给药方式，透过血脑屏障，进入大脑组织和细胞，明显改善大鼠脑梗死体积，起到治疗脑卒中的作用，甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽实现常规静脉给药，作用明显优于现有临床使用药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药领域，具体来说涉及甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸(Gly-L-Cys-L-Phe，简称GCF)三肽在脑卒中药物制备中的应用。
技术介绍
脑卒中(stroke)，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，临床上表现为一次性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑卒中按其性质分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。脑卒中是严重危害人类生命安全的难治性疾病，具有高发病率、高致残率和高死亡率的特点，在2008年我国卫生部公布的死因顺位中，脑卒中在城市中排名第三位，在农村中为第二位的致死原因，其中缺血性脑卒中占卒中病人综述的75％-85％。因此，研发出一种抗缺血性脑卒中的药物具有广阔的医学应用前景。目前临床上缺血性脑卒中治疗方式有以下几类：(1)溶栓药物。在急性超早期即复流时间窗内，如果患者的条件符合溶栓的要求，可使用溶栓药物进行溶栓，这在临床上是缺血性脑卒中急性期采取的最有效治疗措施之一。但是，溶栓药物的剂量以及有效时间窗等研究仍然不成熟，还有待于进一步的探索研究。(2)神经保护药物。大多数的神经保护药物是在细胞损伤瀑布级联效应启动前阻断神经元损伤或凋亡的多个环节发挥保护作用，或对神经元具有营养作用能够促使神经元的修复。近年来关于神经保护药物的研究主要集中在已上市药物依达拉奉，NMDA受体阻断剂和Ca2+通道阻断剂等。几乎所有这些神经保护药物在动物实验中都被证明具有神经保护作用，但是临床试验却被证实无效>或者是效果很差，甚至有些药物具有明显的毒副作用，产生患者无法忍受的中枢神经系统不良反应或其他脏器毒性，使得神经保护的研究停滞不前。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的问题，提供了一种新的化合物甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽，简称GCF，它是由甘氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸三种天然氨基酸为原料脱水缩合而成，其结构式为：本专利技术的目的之二是提供甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在脑卒中药物制备中的应用。本专利技术用培养12天的原代皮层神经元作为实验对象，用不同浓度GCF处理神经元后，用cck8的方法评价细胞活力，从而判断GCF细胞毒性；检测Akt磷酸化水平(p-Akt)判断GCF对神经细胞是否具有保护作用，Akt磷酸化水平越高保护作用越强。结果可见，用不同浓度GCF处理神经元12h，GCF浓度低于10mM时，GCF对于神经元具有保护作用，并且随着GCF浓度增大保护作用愈加明显；当浓度在10mM水平时保护作用最强。同时，用细胞外液(ECS)处理原代神经元1h，目的是降低细胞内p-Akt基础表达水平，再用不同浓度GCF处理神经元，收集细胞蛋白用western比较各组之间Akt磷酸化程度，发现GCF浓度高于200μM时p-Akt表达增加，并且当GCF浓度在800μM水平时，Akt磷酸化水平最高，具有统计学意义(***p<0.01)。(见附图2)本专利技术用SD大鼠作为实验对象，采用脑中动脉阻断法(MCAo)制备脑缺血大鼠模型，缺血3小时后静脉注射药物，1小时后取脑，脑组织冰冻切片，在荧光显微镜下观察脑片中荧光物质强度。采用静脉注射FITC(异硫氰酸荧光素,紫外激发可发绿色荧光；8μmol/kg)标记大鼠脑神经细胞，结果可见未缺血大鼠脑组织中未见荧光标记的神经细胞；缺血大鼠脑组织中镜下可见极少量FITC标记的绿色荧光神经细胞；脑缺血后注射FITC-GCF(8μmol/kg),镜下可见大量荧光标记的神经细胞，并且荧光强度高(见附图3)，表明GCF在大鼠缺血情况下，可以通过静脉注射方式透过血脑屏障进入大脑。本专利技术用SD大鼠作为实验对象，静脉注射给予GCF(10mg/kg)、依达拉奉(临床脑卒中治疗药物；6mg/kg)，采用MCAo脑缺血大鼠模型，缺血后5h，静脉一次性注射上述药物。24h后，处死动物，取脑，后TTC染色，梗死体积用([(VC－VL)/VC]表示,VC是对照半球体积，,VL是损伤半球非梗死体积)。结果可见,注射生理盐水的脑缺血大鼠，梗死体积0.3369±0.023；给予10mg/kgGCF，梗死体积0.023±0.004；注射6mg/kg依达拉奉，梗死体积为0.1373±0.021；相对于静脉给生理盐水和依达拉奉组，给GCF三肽药组有更低的梗死体积，并且有统计学意义(p<0.05)(见表1，附图4)。本专利技术提供的三肽可以通过常规静脉给药方式，透过血脑屏障，进入大脑组织和细胞，明显改善大鼠脑梗死体积，起到治疗脑卒中的作用，该三肽作用明显优于现有临床使用药物。附图说明图1：甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽的HPLC图谱以及质谱图，该三肽由本实验室自主合成。图2：GCF对皮层神经元存活的影响。图3：FITC-GCF在大鼠脑缺血情况下，透过血脑屏障，进入大脑。图4：缺血大鼠静脉注射GCF，可明显改善缺血大鼠脑梗死体积，发挥脑保护作用。具体实施方式通过结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。【实施例1】甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽(Gly-Cys-Phe)的制备过程如下：一、复合物IFmoc-L-Phe-树脂的合成：本专利三肽用固相合成的方法，称取取代度为0.4mmol/g的2-氯三苯甲基氯树脂(2-ChlorotritylChlorideResin)10.7g，将树脂放入多肽反应管中，加入二氯甲烷(DCM)160.5ml,震荡30分钟；通过沙芯抽滤掉DCM溶剂，加入12mmol的Fmoc-L-Phe-OH氨基酸，再加入40mmol的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振荡1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分钟后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分钟后抽掉哌啶溶液，从管中取反应后的树脂十几粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应，说明Fmoc-L-Phe-OH与树脂联接成功，形成复合物IFmoc-L-Phe-树脂。二、复合物IIFmoc-Cys(Trt)-L-Phe-树脂的合成：多肽反应管分别用160.5mlDMF洗两次，160.5ml甲醇洗两次，160.5mlDMF再洗两次；后在Fmoc-L-Phe-树脂复合物上联接第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
甘氨酸‑L‑半胱氨酸‑L‑苯丙氨酸三肽，其特征在于，三肽的结构式为

【技术特征摘要】
1.甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽，其特征在于，三肽的结构式为
2.权利要求1所述的甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒中的
药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽在制备治疗脑卒
中的药物中的应用，其特征在于，甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽的动物
给药量为4mg/kg·d～300mg\...

【专利技术属性】
技术研发人员：万芪，庄扬，陈娟，万沙，
申请(专利权)人：武汉弘跃医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42