本发明专利技术涉及一种缢蛏活性三肽，其氨基酸系列为：Asp-Tyr-His，通过以下步骤制得：新鲜缢蛏去壳取肉，缢蛏肉洗净后捣碎，进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值备用；在上述匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，将所得酶解样品进行超滤，分别收集各分子量段的酶解液组进行冷冻干燥；对各分子量段的酶解液组进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进行氨基酸测序，获得所述缢蛏活性三肽。该缢蛏活性三肽对人前列腺癌PC-3细胞的最大增殖抑制率可达98.94％，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础。该缢蛏活性三肽通过生物酶解方式获得，原料来源广泛，成本低，对进一步研究和开发以缢蛏为基础的药物、提供缢蛏的经济价值具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物活性肤领域，尤其涉及一种溢赔活性H肤及其制备方法和应用。
技术介绍
溢赔（Sinonova州Iaconstricta)俗名赔子，属瓣離纲、异齿亚纲、帘始目、灯培始 科、溢赔属，在我国沿海均有分布，产量较大，为我国四大养殖贝类之一。溢赔肉味鲜美、性 寒、营养丰富，富含人体生命活动所需的各种必需氨基酸、不饱和脂肪酸等营养物质可补阴 去邪热，治烦闷、冷痴、热痴、妇人产后虚损、虚热等症，具有较高的药用食用价值。 活性肤是由两个或两个W上的氨基酸W肤键相连的化合物，在人体内起重要生理 作用，发挥生理功能，如；调节体内的水分、电解质平衡；促进伤口愈合；修复细胞、改善细 胞代谢，能起到防癌作用等。活性肤一般通过酶解生物活性材料获得，郑惠娜等发现食物蛋 白通过蛋白酶酶解方式，可W得到功能多样的活性多肤（《海洋蛋白酶解制备生物活性肤 的研究进展》，郑惠娜、章超枠、曹文红，水产科学，2008, 27 (7)，370)。在对溢赔肉的蛋白酶 解产物研究方面，雷晓凌等对溢赔肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖胺聚糖对体 外培养的化-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强（《溢赔糖胺聚糖 的提取分离及其体外抗肿瘤活性的初步研究》，雷晓凌、吴红棉、范秀萍等，药物生物技术， 2004,11(3) =146-149);张永娟等研究发现提取的溢赔多肤能促进小鼠胸腺和脾脏发育及 迟发型变态反应的发生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平（《溢赔多肤的免疫调节及 抗氧化作用》，张永娟、郑惠娜，时珍国医国药，2011,22巧）；1076-1077)。然而，上述研究一 般仅涉及溢赔蛋白酶解多肤混合物的研究，对具体的功能性多肤单体未进一步进行研究， 本申请通过提取溢赔活性H肤，对溢赔的抗肿瘤活性进行进一步研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种溢赔活性H肤。 本专利技术所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述溢赔活性H 肤的制备方法。 本专利技术所要解决的第H个技术问题是针对现有技术而提供一种上述溢赔活性H 肤的应用。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为；一种溢赔活性H肤，其氨基酸系 列为；Asp-Tyr-HiS。 -种如权利要求1所述的溢赔活性H肤的制备方法，包括W下步骤： (1)新鲜溢赔去壳取肉，洗净后捣碎，按料液比1:1~3加水进行组织匀浆，匀浆后 调节匀浆液抑值为2~3. 5备用； (2)在上述匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，酶解温度为30~ 45°C，加酶量为300~1200U/g溢赔肉，酶解时间为2~化，酶解完成后于95~IOOC、10~ 15min进行灭酶； (3)将上述酶解样品过5KD、8KD超滤膜进行超滤，分别收集分子量大于8邸、分子 量为8~5KDW及分子量小于5KD的酶解液组进行冷冻干燥； (4)对步骤（3)中收集各分子量段的酶解液分别进行反相高效液相色谱纯化，收 集各峰组分并进行氨基酸测序，获得所述溢赔活性H肤。 作为优选，溢赔活性H肤的制备方法为；（1)新鲜溢赔去壳取肉，洗净后捣碎，按 料液比1:1加水进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液抑值为3备用； (2)在上述匀浆液中加入胃蛋白酶进行酶解，获得酶解样品，酶解温度为45C，加 酶量为300U/g溢赔肉，酶解时间为化，酶解完成后于95~IOOtMO~15min进行灭酶； (3)将上述酶解样品过5KD超滤膜进行超滤，收集分子量小于5KD的酶解液进行冷 冻干燥； (4)对步骤（3)中收集的酶解液进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进 行氨基酸测序，获得所述溢赔活性H肤； 前述反相高效液相色谱条件为；AgilentC18色谱柱4. 6X250mmSum,检测波长 280皿，柱温为20°C，进样量为IOOul，梯度洗脱，流速为1.Oml/min，流动相A为0. 06%TFA， B为0. 05 %TFA的己腊，洗脱程序；0 %~1 %B洗脱4分钟，O%~7 %B洗脱25分钟，7 %~ 100%B洗脱1分钟，100 %~100%B洗脱5分钟。 一种上述溢赔活性H肤在抗肿瘤药物中的应用。 所述抗肿瘤为抑制肿瘤细胞的增殖活性，所述肿瘤为人前列腺癌。 进一步，所述溢赔活性H肤对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制率与浓度和作用 时间呈依赖关系，当浓度为5~15mg/ml，作用时间为24~72h时，增殖抑制率为49. 75~ 98. 94%。[002。 再进一步，所述溢赔活性H肤的浓度为lOmg/ml，作用时间为7化时，对人前列腺 癌PC-3细胞的最大增殖抑制率为98. 94%。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于；本专利技术提供了一种全新的溢赔活性H肤， 能较好地抑制人前列腺癌细胞增殖活性，对人前列腺癌PC-3细胞的最大增殖抑制率可达 98. 94%，体外抗前列腺癌效果显著，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础。该溢赔活 性H肤通过生物酶解方式获得，原料来源广泛，成本低，同时模拟人体内部消化环境，采用 胃蛋白酶进行酶解，酶解方式温和，酶解产品贴合人体自然需要，对进一步研究和开发W溢 赔为基础的药物、提供溢赔的经济价值具有重大意义。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中分子量小于5KD的酶解液反相高效液相色谱图。【具体实施方式】W下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。[002引实施例1 ;溢赔活性立肤的制备[002引 1、前处理： 取新鲜溢赔，去壳取溢赔肉，洗净后渐干备用。2、胃蛋白酶解 2.I用高速组织捣碎机将溢赔肉捣碎，加入蒸傭水匀浆，料液比I:I~3,精密称取 匀浆液，用0.Imol/L的盐酸溶液和0.Imol/L的化OH溶液调节匀浆液抑值，加入胃蛋白 酶酶解数小时，酶解条件为：酶解温度30~45°C，抑为2~3. 5,酶解时间2~化，加酶量 300~1200U/g溢赔肉。酶解结束后于100°C下灭酶15min，4°C下离必15min(10000r/min)， 取上清液备用。 2.2胃蛋白酶解工艺优化[003。2.2. 1选用胃蛋白酶，WA(温度）、B(pH)、C(加酶量）、D(料液比）和E(时间）5 个因素，选4个水平进行Lw(45)的正交实验，通过MT法筛选在不同酶解条件下的酶解液 对前列腺癌细胞增殖抑制率最高的酶解条件，从而确定最佳水解条件，并进行大量酶解。胃 蛋白酶因素和水平如表1所示：表1胃蛋白酶的因素与水平 2. 2. 2本实施例中选取前列腺癌细胞PC-3激素非依赖型细胞（原购自中科院上海 细胞库，由本实验室传代保存），细胞培养过程如下：[00对（1)、细胞复苏 从液氮罐中取出存放的PC-3细胞株，快速的放入37C恒温水浴锅中进行融化，待 融化后进入无菌工作室进行操作，用灭菌好的吸管将细胞株吸入离必管，加入2mL的F12营 养液或RPMI1640营养液，100化pm离必lOmin，去上清液，加入4ml的营养液，反复吹打使 细胞成为单个细胞。然后用吸管将细胞均匀的吸入到2个25mL的培养瓶中，放入5% 0)2、 37C的恒温培养箱培养，次日换液倒掉未贴壁的死亡细胞。 似、细胞培养 将人前列腺癌细胞PC-3接种到分别含有10 %胎牛血清（体积分数）FBS和双抗 (青霉素G本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种缢蛏活性三肽，其氨基酸系列为：Asp‑Tyr‑His。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄芳芳，丁国芳，杨最素，余方苗，赵玉勤，
申请(专利权)人：浙江海洋学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。