【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，具体地涉及toll样受体5基因条件过表达动物模型。
技术介绍
1、toll样受体(toll-like receptors，tlrs)是i型跨膜蛋白质，识别侵入体内的微生物进而激活免疫细胞的应答，在先天性免疫系统中起关键作用。toll样受体5(tlr5)是toll样受体家族成员中的一员，在许多免疫细胞如单核巨噬细胞及组织细胞如小肠上皮细胞等表达显著。目前研究发现，鞭毛蛋白(flagellin)是tlr5的唯一配体。近年的研究发现，tlr5与人类多种感染性疾病、自身免疫性疾病以及代谢性疾病的致病性和宿主免疫性有关。
2、目前在tlr5相关研究中，tlr5缺陷小鼠是重要的研究工具。但在其它toll样受体相关研究中，许多研究者也会采用toll样受体过表达小鼠进行研究。如研究发现，tlr4过表达小鼠较野生型小鼠在接受致癌剂后，更易导致散发性结肠癌。然而，目前尚没有tlr5过表达小鼠的相关报道，因为研究者无法开展tlr5与肠炎沙门菌相关研究。
3、因此，本领域迫切需要构建tlr5条件性基因过表达小鼠，从而为研究tlr5功能提供新的实验工具，并且由于tlr5受体功能广泛，故tlr5条件性基因过表达小鼠可能在抗病毒、抗细菌免疫、抗肿瘤免疫、炎症性肠病诊治等方面均有应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就是提供一种toll样受体5基因条件过表达小鼠。
2、本专利技术的另一目的是提供tlr5条件性过表达小鼠在抗病毒、抗细菌免疫、抗肿瘤
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种tlr5基因条件性过表达非人模型动物的制备方法，包括步骤：
4、(a)通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和grna；
5、(b)构建同源重组载体(donor vector)，所述载体包含5'同源臂、tlr5基因表达盒和3'同源臂；其中，所述的tlr5基因表达盒是沉默型表达盒，并且在诱导条件下，所述沉默表达盒被转化为激活型tlr5基因表达盒；
6、(c)在体外将cas9 mrna、grna和所述同源重组载体注射到受精卵中，从而获得经注射的受精卵；
7、(d)将经注射的受精卵再生成tlr5基因条件性过表达非人模型动物。
8、在另一优选例中，所述的模型动物包括f0代和f1代沉默型的tlr5基因条件性过表达非人模型动物。
9、在另一优选例中，在步骤(d)中还包括：将沉默型的tlr5基因条件性过表达非人模型动物与条件诱导型动物进行杂交，形成激活的tlr5基因条件性过表达非人模型动物。
10、在另一优选例中，所述的条件诱导动物为cre动物。
11、在另一优选例中，所述的cre动物为dppa3-cre动物。
12、在另一优选例中，所述的grna的序列如seq id no:8所示。
13、在另一优选例中，通过无缝克隆(in-fusion cloning)的方式构建同源重组载体。
14、在另一优选例中，所述的沉默型tlr5基因表达盒具有如式(i)所示的从5'到3'的结构：
15、z0-z1-z2a-z3-z2b-z4-z5-z6(i)
16、式中，
17、z0为无或5'同源臂；
18、z1为启动子；
19、z2a和z2b为loxp元件；
20、z3为终止密码子；
21、z4为kozak序列；
22、z5为tlr5编码序列；
23、z6为无或3'同源臂。
24、在另一优选例中，所述的激活型tlr5基因表达盒具有如式(ii)所示的从5'到3'的结构：
25、z0-z1-z2-z4-z5-z6(ii)
26、式中，
27、z0、z1、z4、z5、z6如上定义；
28、z2为z2a和z2b重组后的loxp元件。
29、在另一优选例中，所述的方法还包括：对f0代沉默型动物进行基因型鉴定。
30、在另一优选例中，所述的基因型鉴定包括对f0代沉默型动物的5'同源臂和3'同源臂基因型进行pcr鉴定。
31、在另一优选例中，对f0代动物5'同源臂基因型进行pcr鉴定的引物如seq idno:9和10所示，对f0代动物3'同源臂基因型鉴定的引物如seq id no:11和12所示。
32、在另一优选例中，所述方法还包括：对f1代沉默型动物进行基因型鉴定。
33、在另一优选例中，所述基因型鉴定包括对f1代沉默型动物的5'和3'同源臂基因型进行pcr鉴定。
34、在另一优选例中，所述方法还包括：对所述的激活的tlr5基因条件性过表达模型动物进行基因型鉴定。
35、在另一优选例中，所述基因型鉴定引物如seq id no:13～16所示。
36、在另一优选例中，所述的动物包括啮齿类动物。
37、在另一优选例中，所述的啮齿类动物包括小鼠或大鼠。
38、在本专利技术的第二方面，提供了一种基因编辑试剂，所述试剂包括：
39、(i)第一试剂，所述的第一试剂为序列如seq id no：8所示的grna、或所述grna的前体、或含所述grna编码序列的载体；
40、(ii)第二试剂，所述的第二试剂为crispr/cas9基因编辑酶或其表达盒、或用于表达所述基因编辑酶的载体。
41、在另一优选例中，所述试剂还包括：
42、(iii)第三试剂，所述的第三试剂为tlr5基因表达盒、或含有所述表达盒的载体。
43、在另一优选例中，所述试剂还包括：
44、(iv)第四试剂，所述的第四试剂为序列为seq id no:9和10所示的f0代动物3'同源臂基因型鉴定的引物，和序列为seq id no:11和12所示的f0代动物3'同源臂基因型鉴定的引物；
45、(v)第五试剂，所述的第五试剂为序列为seq id no:13～16所示的激活的tlr5基因条件性过表达动物模型基因型鉴定的引物。
46、在本专利技术的第三方面，提供了一种本专利技术第二方面所述的基因编辑试剂的用途，用于制备本专利技术第一方面所述的tlr5基因条件性过表达动物模型。
47、在另一优选例中，所述的动物模型为非人哺乳动物，较佳地啮齿动物，更佳地小鼠或大鼠。
48、在另一优选例中，所述的基因编辑试剂，通过表达所述载体被导入细胞。
49、在另一优选例中，所述的表达载体为病毒载体、哺乳动物细胞载体。
50、在本专利技术的第四方面，提供了一种模型动物的用途，所述模型动物是用本专利技术第一方面所述的方法制备的，其中所述模型动物用于：
51、(iii)筛选治疗感染性疾病、肿瘤相关性疾病以及代谢性疾病的候选药物或治疗剂；和/或
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1.一种TLR5基因条件性过表达非人模型动物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的gRNA的序列如SEQ ID NO:8所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的模型动物包括F0代和F1代沉默型的TLR5基因条件性过表达非人模型动物。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(d)中还包括：将沉默型的TLR5基因条件性过表达非人模型动物与条件诱导型动物进行杂交，形成激活的TLR5基因条件性过表达非人模型动物。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的沉默型TLR5基因表达盒具有如式(I)所示的从5'到3'的结构：
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的激活型TLR5基因表达盒具有如式(II)所示的从5'到3'的结构：
7.一种基因编辑试剂，其特征在于，所述试剂包括：
8.如权利要求7所述的基因编辑试剂，其特征在于，所述试剂还包括：
9.如权利要求7所述的基因编辑试剂的用途，其特征在于，用于制
10.一种模型动物的用途，其中所述模型动物是用权利要求1所述的方法制备的，其特征在于，所述模型动物用于：
...【技术特征摘要】
1.一种tlr5基因条件性过表达非人模型动物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的grna的序列如seq id no:8所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的模型动物包括f0代和f1代沉默型的tlr5基因条件性过表达非人模型动物。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(d)中还包括：将沉默型的tlr5基因条件性过表达非人模型动物与条件诱导型动物进行杂交，形成激活的tlr5基因条件性过表达非人模型动物。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵旭，郭蓓宁，夏敬文，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：
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