【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体来说是一种基于3d类器官联合基因编辑构建肺结癌转化动物模型的方法。
技术介绍
1、肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，早期肺癌往往表现为肺部结节。近年来，随着ct影像的快速发展和肺癌筛查的普及应用，肺结节全球检出率显著提高。如何有效截断肺结节到肺癌的恶性转化已成为我国医疗卫生系统面临的一个巨大课题。目前，临床上对于进展缓慢或长期不变化的结节多以随访观察为主，缺乏有效预防和治疗药物。
2、相较于临床较长的研究周期，实验研究能更快地回答中医经方疗效和作用机制的问题。稳定且可重复的、接近临床病理特征的肺结节动物模型不仅是肺结节发病机制研究的关键工具，而且在治疗肺结节、预防肺癌的药物研发中有着无可替代的地位。肺癌中最常见的组织类型是非小细胞肺癌(non-smalcellung canr,nsclc)，而肺腺癌是最常见的nsclc类型。大多数肺腺癌是沿着非典型腺瘤样增生发展成原位腺癌，再演变到微浸润腺癌，接着逐步发展成具有贴壁样生长模式的浸润性腺癌。因此，肺腺癌动物模型通常伴随着aah、肺腺瘤、增生等病变，大多由化合物或基因突变诱导产生。
3、然而相关基础实验研究有限，肺结节诊疗水平的提高受到严重制约。当前，肺结节实验研究的难点在于动物建模，由于肺结节病因尚不明确，良恶性的判断基于后期观察，因此肺结节的动物建模十分困难。目前文献中采用的特异性致病原，如乌拉坦等致癌物、kveim抗原、弗氏完全佐剂、结核分歧杆菌、外源性粒子(pm2.5，硅尘颗粒等)，但这种造模方式不仅周期长，通常需要
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于3d类器官联合基因编辑构建肺结癌转化动物模型的方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种肺结癌转化动物模型的构建方法，所述方法基于3d类器官联合基因编辑构建，具体为：取trp53基因缺失的小鼠正常肺上皮类器官培养，提取小鼠肺组织并构建含有k-ras目的基因表达载体后提取质粒，采用磷酸钙转染法包装逆转录病毒，利用病毒颗粒对类器官进行感染，将基因编辑成功的类器官按1：3的比例进行传代扩增，将处于对数生长期的类器官进行he和ihc染色鉴定后制备类器官悬液，在10秒内将300,000个75μl的细胞注射到小鼠肺左叶，然后立即进行切口缝合，术后定期监测小鼠的体重、行为和健康状况，通过micro ct技术观察肺结节大小，在第4、6、10周采集小鼠肺组织进行he和ihc染色，用于评估肿瘤的生物学特性。
3、进一步的，所述k-ras目的基因的cds区序列如seq id no.1所示。
4、进一步的，构建表达载体所用的引物序列为：正向引物序列为5′-atgactgagtataaacttgtggtgg-3′，反向引物序列为5′-tcacataactgtacaccttgtcctt-3′。
5、进一步的，类器官感染后还包括类器官基因编辑效率验证，取感染后的肺类器官提取细胞基因组，q-pcr验证类器官基因编辑效率，确保肺类器官k-ras基因编辑成功。
6、进一步的，传代扩增所用细胞培养瓶均需包被基质胶。
7、本专利技术方法构建的肺结癌转化动物模型在肺结节恶性演进、肺癌发生机制探索等基础研究的应用。
8、本专利技术的有益技术效果是：在本专利技术的技术方案中，用cdna过表达技术对小鼠肺类器官进行基因编辑后，可以有效和快速地生成在基因组和表型水平上密切模仿人类疾病的发生发展，模型具有稳定性、可控性，能弥补传统动物体内肺结节造模方式存在迟滞性、不可控性等建模技术瓶颈。
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1.肺结癌转化动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法基于3D类器官联合基因编辑构建，具体为：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述K-ras目的基因的CDS区序列如SEQ IDNo.1所示。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，构建表达载体所用的引物序列为：正向引物序列为5′-ATGACTGAGTATAAACTTGTGGTGG-3′，反向引物序列为5′-TCACATAACTGTACACCTTGTCCTT-3′。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，类器官感染后还包括类器官基因编辑效率验证，取感染后的肺类器官提取细胞基因组，q-PCR验证类器官基因编辑效率，确保肺类器官K-ras基因编辑成功。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，传代扩增所用细胞培养瓶均需包被基质胶。
6.权利要求1-5任一项所述方法构建的肺结癌转化动物模型在肺结节恶性演进、肺癌发生机制探索中的应用。
【技术特征摘要】
1.肺结癌转化动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法基于3d类器官联合基因编辑构建，具体为：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述k-ras目的基因的cds区序列如seq idno.1所示。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，构建表达载体所用的引物序列为：正向引物序列为5′-atgactgagtataaacttgtggtgg-3′，反向引物序列为5′-tcacataactgtacacct...
【专利技术属性】
技术研发人员：任益锋，马琼，曾潇，黄春霞，何佳玮，付西，由凤鸣，
申请(专利权)人：成都中医药大学附属医院四川省中医医院，
类型：发明
国别省市：
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