【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体来说是一种微生物感染肺结癌转化动物模型构建方法和应用。
技术介绍
1、肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，早期肺癌往往表现为肺部结节。近年来，随着ct影像的快速发展和肺癌筛查的普及应用，肺结节全球检出率显著提高。如何有效截断肺结节到肺癌的恶性转化已成为我国医疗卫生系统面临的一个巨大课题。肺结癌转化并非孤立性事件，肺内驱动基因和肺外环境因素的多层叠加效应驱动着肺癌的发生。
2、微生物作为一种环境刺激因子，近年来的研究表明，特定微生物可能在肺结节恶性演进发展中发挥着重要作用。然而，尽管已经有了一些肺结节模型和微生物感染模型，但这些模型在研究微生物感染如何影响肺癌转化方面仍存在局限性。现有的肺结节模型主要集中在化学诱导或基因改造等方面，不仅造模周期长、无法精准再现肺结节的病理发展阶段。更为关键的是，当前这些模型难以恰当模拟微生物感染肺内而不出现严重肺部感染、小鼠死亡等副反应和毒性，从而无法准确反映微生物感染对肺结节恶性演进的影响。因此，有必要开发一种新的动物模型，以模拟特定微生物感染在肺结癌转化中的作用，为肺结节的基础研究提供更具临床意义的动物模型。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种微生物感染肺结癌转化动物模型构建方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种微生物感染肺结癌转化动物模型的构建方法，步骤包括：
3、s01.取trp53基因缺失小鼠肺组织，经剪切、胶原酶消化后，使用添加多种
4、s02.将类器官从基质胶中解离，构建靶向k-ras基因特定区域的cdna表达载体，进行k-ras质粒提取，再感染类器官；
5、s03.利用luciferace、qpcr鉴定验证类器官基因编辑效率，确保肺类器官trp53、k-ras基因编辑成功；
6、s04.将处于对数生长期的类器官进行he和ihc染色，用于确认tk类器官的病理情况；
7、s05.rna-seg技术对tk类器官进行表型分析，包括细胞增殖、分化、迁移和信号传导途径的分析，以评估k-ras突变对类器官功能的影响；
8、s06.将tk类器官悬液皮下注射到小鼠右腋下，1周后用抗生素灭活的牙龈卟啉单胞菌注射到肿瘤部位感染小鼠，每周三次；
9、s07.术后定期监测小鼠的体重、行为和健康状况，通过ivisspectrum成像系统观察出现肿瘤细胞荧光情况、micro ct技术观察肺结节大小；
10、s08.在4、6、10周，采集小鼠肺组织进行he和ihc染色，用于评估肿瘤的生物学特性；
11、s09.使用qpcr技术，检测瘤内牙龈卟啉单胞菌的感染情况，确证牙龈啉单胞菌在肿瘤组织内定植。
12、进一步的，步骤s01中，所述生长支架包括：glutamax、b27 supplement、n2、gastrini、n-acetylcysteine、nicotinamide、mouse recombinant egf、mouserecombinant noggin、mouse recombinantfgf 10、r-spondin 1、10％wnt-3a、y27细胞因子和补充物。
13、进一步的，步骤s02中，所述靶向k-ras基因序列如seq id no.1所示。
14、进一步的，步骤s02中，构建表达载体时，所有引物序列为：正向引物序列为5′-atgactgagtataaacttgtggtgg-3′，反向引物序列为5′-tcacataactgtacaccttgtcctt-3′。
15、进一步的，步骤s02中，感染类病毒所用的病毒采用磷酸钙转染法包装逆转录病毒。
16、进一步的，步骤s06中，注射量为每只注射0.1ml/2×106类器官悬液。
17、本专利技术的有益技术效果是：在本专利技术的技术方案中，利用cdna过表达联合类器官培养技术，有效和快速地生成在基因组和表型水平上密切模仿肺结节恶性进展的肺结癌转化动物模型，而且能够通过定量、定时的菌液注射恰当模拟微生物的体内感染过程、能弥补传统感染微生物的肺结节造模方式不可控性、感染成功率低等建模技术瓶颈。
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1.微生物感染肺结癌转化动物模型的构建方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S01中，所述生长支架包括：GlutaMax、B27 supplement、N2、gastrinI、N-Acetylcysteine、Nicotinamide、mouse recombinantegf、mouse recombinant noggin、mouse recombinant FGF 10、R-Spondin 1、10％wnt-3A、Y27细胞因子和补充物。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S02中，所述靶向K-ras基因序列如SEQID No.1所示。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S02中，构建表达载体时，所有引物序列为：正向引物序列为5′-ATGACTGAGTATAAACTTGTGGTGG-3′，反向引物序列为5′-TCACATAACTGTACACCTTGTCCTT-3′。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S02中，感染类病毒所用的病毒采用磷酸钙转染法包装逆转录病毒。<...
【技术特征摘要】
1.微生物感染肺结癌转化动物模型的构建方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s01中，所述生长支架包括：glutamax、b27 supplement、n2、gastrini、n-acetylcysteine、nicotinamide、mouse recombinantegf、mouse recombinant noggin、mouse recombinant fgf 10、r-spondin 1、10％wnt-3a、y27细胞因子和补充物。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤s02中，所述靶向k-ras基因序列如seqid no.1所示。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：马琼，任益锋，曾潇，黄春霞，何佳玮，付西，由凤鸣，
申请(专利权)人：成都中医药大学附属医院四川省中医医院，
类型：发明
国别省市：
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