【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种aunps/dnazyme/sirna复合纳米探针及其制备方法和应用。
技术介绍
1、肺癌在中国的发病率和死亡率均位于恶性肿瘤第一位，非小细胞肺癌(nsclc)是肺癌的主要类型，占肺恶性肿瘤的85％，5年生存率低于15％。肿瘤转移是肿瘤死亡率高的重要原因，约90％的患者死亡是因为肿瘤发生了转移。其中脑膜转移(lm)是最具挑战性的难题，nsclc是引起脑膜转移最主要的恶性肿瘤。lm以脑和脊髓的软脑膜内转移性肿瘤细胞浸润为特点，并可随血管周围间隙侵入脑实质，但在颅内不形成肿块，早期肿瘤脑膜转移影像学难以精确诊断。由于软脑膜转移的弥漫性，手术切除或活检不可行。因此，脑脊液(csf)的细胞学检查发现肿瘤细胞仍是诊断lm的金标准。然而，脑脊液中的细胞数目相对较少且数量不一，脑脊液细胞学检测还依赖于细胞收集方法、技术人员的能力等，这就导致了脑脊液细胞学检测主观性强、灵敏度不高，有时需要多次采集以提高其灵敏度，因此检测脑脊液中的相关肿瘤标志物便显示出独特的优势。
2、癌胚抗原相关细胞粘附分子6(ceacam6)是一种由单链糖基磷酸核糖基锚定的细胞膜表面糖蛋白，可以抑制细胞凋亡，在nsclc中表达上调，它参与细胞迁移、侵袭、粘附以及癌细胞转移。研究发现在nsclc-lm患者中检测到ceacam6，而在正常脑脊液中未检测到ceacam6。此外，ceacam6游离rna(cfrna)在nsclc-lm csf中存在，而在对照组中不存在。这些结果提示ceacam6可能作为诊断nsclc-lm的一个有前景
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种aunps/dnazyme/sirna复合纳米探针及其制备方法和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面是提供一种aunps/dnazyme/sirna复合纳米探针，是由包括如下的原料组成：aunps、序列为seq id no.1的特异性靶向ceacam6rna的单链dna-1、能够特异性结合的酶链和荧光修饰的底物链、特异性靶向ceacam6 rna的二硫键修饰的sirna正义链和tamra修饰的的sirna反义链。
4、进一步地，上述aunps由如下方法制备：将四氯金酸溶液加入到去离子水中，接冷凝管，搅拌并加热至液体回流，迅速加入的柠檬酸钠溶液，继续加热得到aunps；优选地，四氯金酸和柠檬酸钠的添加摩尔比为1:2～6；优选地，加热时间为15～30min。
5、进一步地，上述酶链的序列为seq id no.2，底物链的序列为seq id no.5。
6、进一步地，上述sirna正义链的序列为seq id no.3，sirna反义链的序列为seq idno.4。
7、进一步地，aunps、单链dna-1、酶链、底物链、sirna正义链、sirna反义链的摩尔比为1：2～4.5：2～4.5：10～18：10～18：10～18，优选为1：3：3：15：15：15。
8、本专利技术的第二方面是提供上述纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
9、步骤一，将单链dna-1和酶链混合，避光孵育形成双链结构；
10、步骤二，将二硫键修饰的sirna正义链和tamra修饰的sirna反义链混合，避光孵育形成双链结构；
11、步骤三，对fam修饰的底物链进行处理使其形成发夹结构；
12、步骤四，将aunps、单链dna-1与酶链形成的双链、底物形成的发夹结构、二硫键修饰的sirna正义链和tamra修饰的sirna反义链形成的双链混合，避光震荡混合过夜，得到所述纳米探针。
13、进一步地，上述避光孵育的条件为37℃，1.5～4h。
14、进一步地，对fam修饰的底物链的处理方法如下：加热至90～100℃保持3～6min，再程序降温至20～30℃。
15、进一步地，上述制备方法还包括向上述纳米探针加入底物链，避光孵育过夜；最后加入吐温20，并使得探针溶液中吐温20的含量为0.03～0.06。
16、本专利技术的第三方面是提供一种检测ceacam6 rna的试剂盒，其包括上述纳米探针。
17、进一步地，上述试剂盒用于检测患者的脑脊液样本。
18、本专利技术的第四方面是提供一种检测ceacam6 rna的方法，采用上述纳米探针进行检测。
19、本专利技术的第五方面是提供上述纳米探针在制备治疗肺癌的药物中的应用。
20、本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
21、(1)本专利技术利用核酸探针技术特异性识别ceacam6 rna，具有较高的灵敏度，省去了样本的复杂处理，可实现即时检测的效果，能够用于体外样本的检测及活细胞内的原位荧光成像。
22、(2)本专利技术将镁离子特异性的酶切反应整合到靶标的检测中，通过循环切割反应大幅方法检测信号，达到更低的检测限。
23、(3)本专利技术利用aunps作为载体，将核酸探针和sirna高度集成构建诊疗一体化平台，可同时用于ceacam6 rna的检测以及抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。
24、(4)本专利技术操作方法简便，简化了临床检测中样本的复杂处理过程，能够快速、精准、高效的对脑脊液样本中ceacam6 rna进行检测并和活细胞内实现原位荧光成像，满足方法验证中对灵敏度、特异性等方面的要求。
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1.一种AuNPs/DNAzyme/siRNA复合纳米探针，其特征在于，是由包括如下的原料组成：AuNPs、序列为SEQ ID No.1的特异性靶向CEACAM6 RNA的单链DNA-1、能够特异性结合的酶链和荧光修饰的底物链、特异性靶向CEACAM6RNA的二硫键修饰的siRNA正义链和TAMRA修饰的的siRNA反义链。
2.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述AuNPs由如下方法制备：将四氯金酸溶液加入到去离子水中，接冷凝管，搅拌并加热至液体回流，迅速加入的柠檬酸钠溶液，继续加热得到AuNPs；优选地，四氯金酸和柠檬酸钠的添加摩尔比为1:2～6；优选地，加热时间为15～30min。
3.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述酶链的序列为SEQ ID No.2，底物链的序列为SEQ ID No.5。
4.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述siRNA正义链的序列为SEQ IDNo.3，siRNA反义链的序列为SEQ ID No.4。
5.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述AuNPs、单链D
6.如权利要求1-5任一项所述纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述避光孵育的条件为37℃，1.5～4h。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，对所述FAM修饰的底物链的处理方法如下：加热至90～100℃保持3～6min，再程序降温至20～30℃。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，还包括向所述纳米探针加入底物链，避光孵育过夜；最后加入吐温20，并使得探针溶液中吐温20的含量为0.03～0.06
10.一种检测CEACAM6 RNA的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-5任一项所述的纳米探针。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，用于检测患者的脑脊液样本。
12.一种检测CEACAM6 RNA的方法，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述的纳米探针进行检测。
13.如权利要求1-5任一项所述的纳米探针在制备治疗肺癌的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种aunps/dnazyme/sirna复合纳米探针，其特征在于，是由包括如下的原料组成：aunps、序列为seq id no.1的特异性靶向ceacam6 rna的单链dna-1、能够特异性结合的酶链和荧光修饰的底物链、特异性靶向ceacam6rna的二硫键修饰的sirna正义链和tamra修饰的的sirna反义链。
2.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述aunps由如下方法制备：将四氯金酸溶液加入到去离子水中，接冷凝管，搅拌并加热至液体回流，迅速加入的柠檬酸钠溶液，继续加热得到aunps；优选地，四氯金酸和柠檬酸钠的添加摩尔比为1:2～6；优选地，加热时间为15～30min。
3.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述酶链的序列为seq id no.2，底物链的序列为seq id no.5。
4.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述sirna正义链的序列为seq idno.3，sirna反义链的序列为seq id no.4。
5.根据权利要求1所述的纳米探针，其特征在于，所述aunps、单链dna-1、酶链、底物链、sirna正义链、sirna反...
【专利技术属性】
技术研发人员：关明，沈福志，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：
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