用于酶介导的信号放大的新方法技术

本发明专利技术涉及用于对靶标相关信号的酶介导放大以使样本中的生物学靶标或化学靶标可视化的方法和化合物，其中靶标被固定化，具体地，本发明专利技术涉及用于使包括细胞的样本中的靶标可视化的氧化还原酶介导的信号放大。本发明专利技术的方法对于与医疗诊断和疗法相关的生物学标记物的定性和定量评估特别有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于酶介导的信号放大的方法
本专利技术涉及用于靶标相关信号的酶介导放大以使样本中生物靶标或化学标靶可视化的方法和化合物，其中靶标是固定化的。本专利技术的方法可用于对组织学样本中生物标记物的定性和定量评测，特别是可用于诊断应用中。
技术介绍
免疫化学(IHC)是医疗诊断中的常见工具，并且还通常用于对治疗性生物标记物的评估。特别地，生物标记物通常需要对其存在的程度进行定量评估。当这些试剂应用至固定于固体支撑物(support)上或在溶液中的纯化蛋白时，抗体对细胞和组织的应用呈现出在所遇到的情况之外的特异性难题。存在很多能够影响免疫检测的因素，其中有组织的固定和制备、抗原修复的持续时间和类型以及抗体特异性。另一个困难是对以低水平存在的靶标的检测能力。与可溶性测定(assay)相同，增加信号而不提高非特异性背景水平成为问题。最常研究的方法是信号放大，这通过连续几轮的酶促反应来达到。3,3’-二氨基联苯胺(DAB)是辣根过氧化物酶(HRP)的发色底物，其被广泛地用于使组织学样本中标记有过氧化物酶活性的靶标蛋白可视化。该方法利用与靶向样本中蛋白的抗体相连的HRP，将DAB从溶液沉积到靶向蛋白的位点上，由此对蛋白进行标记。该方法不是特别灵敏，因此适合于检测相对大量的靶标蛋白。与DAB沉积相关的信号不能进一步放大。所要提及的其他缺点是，该方法需要相当大量的靶标特异性抗体来充满所有靶标位点，而且相当耗费时间。此外，该方法提供均匀的染色形态，对显微镜工作者显示出均一颜色，且具有细胞结构例如膜、胞质和核的胞内分辨度，这使得不可能准确地使染色定量。近来，已经记载了一种全新的基于HRP-DAB的IHC可视化系统。该系统将DAB不仅用作标记靶标的HRP的发色底物，还用作在HRP的辅助下交联水溶液中其它可检测的HRP底物并将它们沉积在固定化HRP的周围的制剂（参见WO2009036760、WO2010094283和WO2010094284）。在组织学样本中，该方法会生成与传统HRP-DAB染色相似的染色形态，但是，与传统染色相比，该染色更加靶标特异化和灵敏，并且过程更快且稳健。新方法并不使得靶标的量直接接近于样本中染色的量，因为这两个量之间的关联不是线性的。因此，通过所有这些方法可视化的组织学样本中的靶标的量仅可以相对地进行评测，而不是精确地评测。然而，在某些情况下，这种新描述的HRP-DAB靶标标记系统能够很强地放大与单个靶标相关的信号，从而使单个靶标例如单个蛋白或核酸分子可以单独地在样本中可视化为有颜色或荧光的较大点并且通过使用普通低倍的明场或荧光光学显微镜来进行检测（参见WO2011047680）。可以在之后容易地对样本中直径高达4微米的视觉上分开（distinct）的单个点进行手动或自动定量，并且靶标的量可以很精确地确定（参见PCT/DK2011/000131）。
技术实现思路
本专利技术涉及可应用于靶标固定在例如固体支撑物上或固体支撑物内的样本的强大的新型信号放大系统，使得可以将大量样本中的非常宽动态浓度范围内的单独单个靶标实体例如单个生物学分子或化学分子、单个分子结构、单个分子复合物、单个颗粒等可视化为视直径约1微米至约3微米的视觉上分开的点。该系统也可应用于对均质化（homogeneous）染色（即，分辨率没有达到明显的单个点）的固定化靶标进行可视化。根据本专利技术的放大系统包括至少一个在水溶液中孵育假定含有靶标的样本的步骤，该水溶液包含：（i）具有氧化还原酶活性的酶的第一底物；（ii）该酶的第二底物，以及任选地（iii）过氧化物化合物，其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且第二底物是含有一种或多种能够作为有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物（conjugate）分子。根据本专利技术，在上述水溶液中孵育假定包含靶标的样本，使得样本中包含靶标的位点通过结合物分子的沉积而被标记，然而，这仅仅是在靶标包含氧化还原酶活性且靶标固定在样本内或固定在固体支撑物上或固体支撑物内的情况下。固定化靶标可以固有地包含氧化还原酶活性或者其可以通过另一物质与该酶相关联，另一物质为例如包含辣根过氧化物酶（HRP）或大豆过氧化物酶（SP）的靶标特异性结合剂。样本中的靶标通过检测所沉积第二底物的可检测标记物的方式来检测。因此，在一些实施方式中，本专利技术的方法可以包括以下步骤：a）在水溶液中孵育假定含有固定化靶标的样本，该固定化的靶标包含具有氧化还原酶活性的酶，水溶液包含：（i）该酶的第一底物；（ii）该酶的第二底物，以及任选地（iii）过氧化物化合物，其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且第二底物是含有一种或多种能够作为有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子；b）检测样本中第二底物的沉积分子的标记物。在其他实施方式中，本专利技术的方法可以包括以下步骤：a）将假定包含靶标的样本与一种或多种结合剂孵育，其中样本或靶标被固定化，其中至少一种结合剂是靶标特异性结合剂且至少一种结合剂包括具有氧化还原酶活性的酶；b）在水溶液中孵育样本（a），水溶液包含：（i）该酶的第一底物；（ii）该酶的第二底物，以及任选地（iii）过氧化物化合物，其中，第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸（ACHCA）或其衍生物，且第二底物是含有一种或多种能够作为有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子；c）检测样本中第二底物的沉积分子的标记物。术语“任选地”是指过氧化物化合物不是本专利技术所有实施方式的水溶液中的必要成分：当具有氧化还原酶活性的酶是过氧化物酶时，其是溶液的成分，而当酶是酚氧化酶时，其可以从溶液中去掉。在其他实施方式中，本专利技术的方法可以包含一个或多个其他检测步骤，包括使用本专利技术的放大系统或使用其他放大系统例如WO2011047680、WO2009036760、WO2010094283或WO2010094284的放大系统进行的附加信号放大步骤。使用本专利技术放大系统的靶标可视化方法适合于（i）将靶标被固定化的样本中的单个靶标实体可视化为分开的染色（或荧光或放射性）点，其中单个点具有约1～约3微米的视直径并对应于单个靶标单元，以及（ii）将靶标可视化为均质化染色（即，不是由多个分开的染色点例如直径1～3微米的点构成）。本专利技术的可视化系统使得可以使用靶标特异性结合剂的多种组合、多种不同可检测标记物、不同信号放大系统的组合、多种酶底物等来在一个样本中检测多种多样的靶标。本专利技术的一个方面涉及对根据本专利技术可视化的靶标进行定量。样本中的单个靶标实体和靶标总量均能够非常精确地进行定量。本专利技术的另一方面涉及放大系统在医学诊断中作为诊断测定（assay）的一部分的用途。通过本专利技术方法进行诊断靶标检测及定量的灵敏性和精确度对于分子诊断和搭配诊断以及个性化疗法是非常有价值的。本专利技术可视化系统的其他优点是其使用（i）无毒、（ii）无色、（iii）明确的（welldefined）、（iv）稳定的和（v）容易得到的化合物。再一优点是本专利技术的所有方法均可以手动和自动执行。具体实施方式本专利技术涉及可用于使用多种测定形式（format）对多种样本中固定在例如支撑物上的靶标进行可视化和检测的强大的信号放大系统，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测样本中的固定化靶标的方法，其中所述靶标固有地包括氧化还原酶酶促活性或与氧化还原酶酶促活性相连，所述方法包括在水溶液中孵育假定包括所述靶标的样本，所述水溶液包括（i）所述酶促活性的第一底物，以及（ii）所述酶促活性的第二底物，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.19 US 61/476,958;2011.11.08 US 61/556.9171.一种用于非诊断目的的用于检测样本中的固定化靶标的免疫化学方法，其中所述靶标固有地包括具有氧化还原酶酶促活性的酶或与具有氧化还原酶酶促活性的酶相连，所述方法包括在水溶液中孵育假定包括所述靶标的样本，所述水溶液包括(i)所述具有氧化还原酶酶促活性的酶的第一底物，(ii)所述具有氧化还原酶酶促活性的酶的第二底物，以及(iii)过氧化物化合物，其中所述第一底物是α-氰基-4-羟基肉桂酸(ACHCA)，所述第二底物是包括一种或多种能够作为所述具有氧化还原酶酶促活性的酶的底物的化合物以及可检测标记物的结合物分子，其是式(I)的结合物分子：式(I)：(Y)n-L-(Z)m，其中Y是能够作为具有氧化还原酶酶促活性的酶的底物的式(II)的化合物：式(II)：其中R1是-H、-O-X、N(X)2或-S-X；R2是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；R3是-H、-OH、-NH2或-SH；R4是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X；R5是-H、-O-X、N(X)2或-S-X；R6是-CON(X)2或CO-X，其中H是氢；O是氧；S是硫；N是氮；且X是H、烷基或芳基；Z是可检测标记物，L是连接物化合物或化学键，n是1～150的整数，m是1～150的整数，其中α-氰基-4-羟基肉桂酸(ACHCA)的量在0.15mM至50mM的范围内。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有氧化还原酶酶促活性的酶与选自酚氧化酶或过氧化物酶的酶相关联。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有氧化还原酶酶促活性的酶是过氧化物酶。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合物包括至少两个式(II)的化合物Y。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·洛泽，G·斯克拉蒂奇克瓦，
申请(专利权)人：丹麦达科有限公司，
类型：
国别省市：