荧光寿命表观遗传学测定制造技术

本发明专利技术涉及基于测量荧光寿命(FLT)来测定酶活性的方法。特别地，本发明专利技术涉及对能够修饰肽底物结构之酶的测定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脱甲基化、乙酰化、脱乙酰化或脱亚氨化的酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及基于测量荧光寿命(FLT)来测定酶活性的方法。特别地，本专利技术涉及对能够修饰肽底物结构之酶的测定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脱甲基化、乙酰化、脱乙酰化或脱亚氨化的酶。【专利说明】荧光寿命表观遗传学测定
本专利技术涉及基于测量突光寿命(flurescence lifetime, FLT)来测定酶活性的方法。特别地，本专利技术涉及对能够修饰肽底物结构之酶的测定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脱甲基化、乙酰化、脱乙酰化或脱亚氨化(deimination)的酶。
技术介绍
催化其他生物分子之结构修饰的酶是药物发现的重要靶标。例如，催化蛋白质之翻译后修饰的酶(特别是修饰组蛋白结构的酶)，由于其与人类疾病(例如神经变性和癌症)相关而成为有前景的药物靶标。构成组蛋白之氨基酸的翻译后修饰在“表观遗传学(epigenetics) ”领域中特别重要，“表观遗传学”是由除基本DNA序列改变之外的机制引起的表型(外观)或基因表达之可遗传性改变的研究。遗传物质需要保护、包装以及用于调节过程(例如转录、复制和修复)的方法。在真核生物中，这些作用在很大程度上通过将基因组DNA装配成核小体的组蛋白来实施。核小体与许多相关蛋白质包装在一起以形成染色质纤维。每个核小体由几乎缠绕圆柱形蛋白质核心两次的DNA组成，所述蛋白质核心含有每种组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)的两个拷贝。组蛋白的N端尾区从其中存在结构性球状结构域的核小体核心中伸出。为了使组蛋白能够调节多种过程，通过多种翻译后修饰来改变组蛋白。虽然组蛋白修饰在整个序列中均发生，但是组蛋白的非结构性N端(组蛋白尾区)被特别高度地修饰。这些修饰包括乙酰化、甲基化、脱亚氨化、泛素化、磷酸化和苏素化(sumoylation)。乙酰化是这些修饰中研究得最深入的。例如，通过组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferase,HAT)乙酰化组蛋白H3尾区的K14和K9赖氨酸通常与转录能力相关。组蛋白乙酰化调节多个细胞过程，并且特定的乙酰化模式产生不同的结果，例如，新合成的组蛋白上的乙酰化模式对于其通过组蛋白分子伴侣装配成核小体来说是非常重要的。另外，染色质压缩和折叠的程度可受组蛋白H4第16位赖氨酸之乙酰化的调节。最后，组蛋白乙酰化对于基因转录来说是至关重要的。组蛋白的赖氨酸乙酰化通常涉及以较高的转录速率打开染色质结构。组蛋白乙酰化受组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性和脱乙酰酶活性的调节，这对于多种组蛋白以及对于单个组蛋白上的特定位点具有不同偏好(参见Shahbazian和Grunstein (2007)Annual review of Biochemistry,第 76 卷:75-100)。除乙酰化之外，组蛋白(特别是H3和H4)的甲基化对于染色质功能(例如基因表达、DNA复制和染色体分离)的调节也很重要。组蛋白H3的甲基化通常与染色质凝聚相关，从而导致转录抑制。组蛋白仅在精氨酸和赖氨酸残基上被甲基化。精氨酸可以被单甲基化或二甲基化，其中后者为对称或不对称构型。催化该过程的酶分为两种类型，其中I型酶催化Ne-单甲基精氨酸残基和不对称Ne，Ne-二甲基精氨酸残基的形成，而II型酶催化Ne-单甲基精氨酸残基和对称Ne，Ne-二甲基精氨酸残基的形成。与精氨酸甲基化类似，ε-氮上的赖氨酸甲基化也可作为单甲基化、二甲基化或三甲基化形式而发生。组蛋白赖氨酸甲基转移酶(PKMT)负责组蛋白H3和H4的甲基化并且利用称为SET(Supressor of variegation,Enhancer of zeste,Trithorax)结构域的催化活性位点。SET结构域是参与调苄基因活性的130个氨基酸的序列。已证明该结构域与组蛋白尾区结合并引起组蛋白的甲基化。也可通过使用组蛋白赖氨酸脱甲基酶(PKDM)脱甲基化来操纵组蛋白H3和H4。这种最近鉴定的酶类中的一个家族具有称为Jumonji结构域(JmjC)的催化活性位点。当JmjC利用多个辅因子使甲基水解时，发生脱甲基化，从而移除甲基。JmjC能够使单甲基化、二甲基化和三甲基化底物脱甲基化。有越来越多的证据将组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase,HMT)和乙酰转移酶(HAT)与不同病理状况(从恶性肿瘤到神经病)联系起来。因此，鉴定这些酶的抑制剂可提供药物发现的出发点。肽基精氨酸脱亚氨酶(peptidyl arginine deiminase, PAD)是将底物蛋白质上的精氨酸残基在翻译后转化为非标准氨基酸瓜氨酸的钙依赖性酶的家族。PAD催化的瓜氨酸化(伴随有带正电亚氨基的丧失)将强碱性精氨酸残基转化为中性氨基酸。认为由瓜氨酸化引起的碱性电荷丧失破坏了底物蛋白质内的电荷分布并改变了所述蛋白质与其他分子相互作用的能力。通过PAD类酶使组蛋白H2A、H3和H4脱亚氨化抵消了精氨酸甲基化。特别地，PAD4同工型能够催化组蛋白H2A、H3和H4上精氨酸残基的瓜氨酸化(Thompson，P.R.和 Fast, ff.，ACS Chem Biol.2006，1，433-441)。因此，PAD 组的酶可在“组蛋白密码(histone code) ”的修饰中发挥关键作用并因而影响基因转录。PAD酶和瓜氨酸化蛋白质还与多种人类疾病(包括类风湿性关节炎、多发性硬化、阿尔兹海默病)相关并且(更最近地)与癌症相关(Vossaar, E.R.等，Citrullinationof synovial proteins in mouse models of rheumatoid arthritis(2003).ArthritisRheum,第 48 卷:2489-2500 ;Musse, A.A.等，Peptidyl arginine deiminase2(PAD2)over expression in transgenic mice leads to myelin loss in the centralnervous system(2008), Dis Model Mech.第 I 卷:229-240 ；Ishigami, A.等，Abnormalaccumulation of citrullinated proteins catalysed by peptidyl arginine deiminasein hippocampal extracts from patients with Alzheimer' s disease(2005)J NeurosciRes.第 80 卷；120-128 和 Chang X.等.Expression of peptidyl arginine deiminasetype4(PAD4)in various tumours(2006)Mol Carinog.第 45 卷:183-196)。因此，持续需要用于修饰其他生物分子之结构的这类酶(特别是以上所总结的催化组蛋白修饰的酶类)的稳健(robust)且灵敏的测定。特别地，持续需要用于此类酶的稳健、灵敏的测定，其可容易地应用于高通量筛选形式，能够高效地筛选酶抑制剂。已报道了用于鉴定调节组蛋白修饰酶之活性的化合物的多种基于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷厄姆·科顿，科林·邓斯莫尔，
申请(专利权)人：艾尔玛可科学苏格兰有限公司，
类型：
国别省市：