杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体。本发明专利技术提供的杂交瘤细胞株QW8#，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2016164。可以用于制备高亲和力抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体，酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得亲和力可达8.5×10

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体
本专利技术涉及杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体。
技术介绍
拟除虫菊酯是一类低毒、高效、低残留的广谱性杀虫剂。传统的拟除虫菊酯类农药属于羧酸酯化合物，分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类。Ⅰ型拟除虫菊酯主要包括氯菊酯、苯醚菊酯、生物苄呋菊酯、联苯菊酯等，Ⅱ型拟除虫菊酯主要包括氰戊菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氯氢菊酯等。长期低剂量的接触拟除虫菊酯类杀虫剂会引起慢性疾病，有的具有免疫系统毒性和心血管毒性等，而且拟除虫菊酯是一种神经毒剂，会改变神经膜的通透性，影响神经传导从而导致中毒症状，另外其对脑组织生物膜、神经生理学、神经信号转导以及神经递质等方面均有一定的影响。然而，由于拟除虫菊酯的高效及光谱性，其占全球杀虫剂市场的30％，其中95％以上用于农业病虫害的防治，主要用于粮食、蔬菜、茶叶、水果、棉花，少数用于畜禽、公共和家庭卫生害虫的防治，大量广泛的使用难免造成农药残留。因此研究环境以及农产品、食品中痕量拟除虫菊酯杀虫剂的检测方法具有重要的意义。现有拟除虫菊酯农药的检测方法主要分为仪器分析法和酶联免疫分析法。仪器分析法是借助大型精密仪器对拟除虫菊酯进行精确定量检测。主要包括:液相色谱法、气相色谱法、气质联用和液质联用等，该类方法灵敏度高，准确性高等优点，但是其所需的仪器设备昂贵，前处理复杂，限制了其在农药残留现场筛查及检测的大规模推广应用。由于大型仪器分析的局限性，免疫分析被广泛的应用于拟除虫菊酯的定量检测中。该方法将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应高度专一性、特异性相结合，具有简单、快速、灵敏度高等优点，适于现场批量检测等。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对拟除虫菊酯农药的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗拟除虫菊酯农药的抗体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株QW8#及其产生的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体。本专利技术提供了杂交瘤细胞株QW8#，该细胞株已于2016年8月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C2016164。其具有序列表中SEQIDNO:1所示的抗Ⅰ型拟除虫菊酯单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQIDNO:2所示的抗Ⅰ型拟除虫菊酯单克隆抗体可变区编码基因序列。抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCNO.C2016164的杂交瘤细胞株QW8#分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。该抗Ⅰ型拟除虫菊酯单克隆抗体可以广谱识别Ⅰ型拟除虫菊酯，对醚菊酯的50％抑制浓度IC50为20.86μg/L，对氯菊酯的50％抑制浓度IC50为24.2μg/L，对苯醚菊酯的50％抑制浓度IC50为29.4μg/L。抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体在Ⅰ型拟除虫菊酯的多残留测定中的应用。本专利技术所提供的杂交瘤细胞株QW8#是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将原料3-苯氧基苄醇与丁二酸酐反应生成Ⅰ型拟除虫菊酯通用半抗原4-氧代-4-(3-苯氧基苄氧基)丁酸，然后通过活泼酯法与载体蛋白进行偶联，得到完全抗原Hapten-1-BSA。用其免疫BALB/c小鼠4-6次，最后一次加强免疫用2倍于前一次免疫剂量的Hapten-1-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步利用间接非竞争ELISA，筛选出识别二苯醚结构但不识别载体蛋白(BSA)的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行梯度筛选，采用醚菊酯作为竞争原，选择吸光值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株QW8#。本专利技术提供的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株QW8#注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体。按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为：将腹水从-20℃冰箱拿出室温解冻。腹水用双层滤纸过滤初步除去脂肪片、细胞碎片及其他杂质。12000r/min，离心15min，取上清，弃沉淀。精确量腹水体积。取一份体积的腹水与3份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/LHCl调pH至4.5-4.8。在磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，每1mL腹水加33μL正辛酸，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4℃静置2h。然后12000r/min，离心5min，取上清，双层滤纸过滤，收集滤液。量取滤液体积，加入1/10体积的0.1MpH＝7.4的PBS，用2mol/LNaOH(记录NaOH体积)调pH至7.4。将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4℃过夜。之后12000r/min，离心上述液体15min，弃上清。用一定体积的0.01mol/LPBS溶解沉淀。0.01mol/LPBS透析两天。收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20℃预冻后真空冻干成粉保存。醋酸盐缓冲液：0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至100mL；0.1mol/L磷酸盐(PBS)缓冲液：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术提供的杂交瘤细胞株QW8#可以用于制备高效价抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体，抗Ⅰ型拟除虫菊酯小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的亲和力可达8.5×108L/moL。(2)本专利技术提供的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对醚菊酯的50％抑制浓度IC50为20.86μg/L，对氯菊酯的50％抑制浓度IC50为24.2μg/L，对苯醚菊酯的50％抑制浓度IC50为29.4μg/L，对其他Ⅰ型和Ⅱ型拟除虫菊酯菊酯的交叉反应率均小于1％；(3)本专利技术提供的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体可应用于测定Ⅰ型拟除虫菊酯含量。附图说明图1为Ⅰ型拟除虫菊酯通用半抗原4-氧代-4-(3-苯氧基苄氧基)丁酸的合成路线图。具体实施方式实施例1：杂交瘤细胞株QW8#的筛选1.抗原合成及动物免疫购买市售3-苯氧基苄醇标准品进行完全抗原合成，具体的合成步骤如下：将4mg3-苯氧基苄醇溶于2mL氯仿，加入50μL丁二酸酐，混合物在室温下搅拌反应过夜；产物蒸干后用乙酸乙酯萃取2次，得有机层，旋转蒸干，得产物Hapten-1(图1)。取1.0mgHapten-1溶于800μLDMF中，再分别加入0.2mmol的DCC及0.3mmol的NHS，搅拌反应过夜，将混合物逐滴加入4mL10mg/mL的BSA溶液中，室温反应4h；4℃条件下，PBS溶液(磷酸盐缓冲液，pH7.4)透析3d，除去3-苯氧基苄醇及过量的本文档来自技高网...

【技术保护点】
杂交瘤细胞株QW8#，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2016164。

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株QW8#，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.C2016164。2.抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCCNO.C2016164的杂交瘤细胞株QW8#分泌产生。3.根据权利要求2所述的抗Ⅰ型拟除虫菊酯通用单...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，唐晓倩，张奇，张兆威，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42