分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗的应用。用提纯的大麦黄矮病毒(BYDV)PAV株系病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗BYDV PAV的单抗杂交瘤细胞株24G4，其保藏号为CGMCC No.13298。该杂交瘤细胞株分泌的单抗腹水间接ELISA效价达到10

Hybridoma cell line secreting monoclonal antibodies against barley yellow dwarf virus PAV and its monoclonal antibody application

The invention discloses a hybridoma cell line secreting monoclonal antibodies against barley yellow dwarf virus PAV strain and the use of the monoclonal antibody thereof. Purification of barley yellow dwarf virus (BYDV) strains of PAV virus particles as antigen to immune BALB/c mice, through cell fusion, screening and cloning, 1 strains were obtained and passaged stably secreting anti PAV monoclonal antibody BYDV hybridoma cell strain 24G4 and the preservation number of CGMCC No.13298. The ascites monoclonal antibody secreted by the hybridoma cell line has an indirect ELISA titer of 10

【技术实现步骤摘要】
分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。
技术介绍
由大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfviruses,BYDVs)引起的小麦黄矮病(Wheatyellowdwarfdisease)是小麦上重要的病毒病害之一。该病害最早由Oswald和Houston于1951年在美国加利福尼亚州的大麦上发现。目前，小麦黄矮病毒在世界各地均有分布。1960年，BYDVs首次出现在我国西北地区，受到BYDVs侵染的小麦一般减产40％，严重的可达70％以上，因此BYDVs又被称为“小麦癌症”、“黄色瘟疫”。自首次发现以来，小麦黄矮病在20世纪60-80年代又大规模爆发流行了数次，给我国小麦生产和粮食安全带来了重大威胁。BYDVs在小麦秋苗期和春季返青后均可侵染植株，典型症状是新叶从叶尖开始发黄，植株变矮，叶片颜色为金黄色到鲜黄色，黄化部分约占全叶的1/3-1/2。秋苗期感病的植株矮化明显，分蘖减少，一般不能安全越冬。即使能越冬存活，一般也不能抽穗。穗期感病的植株一般只旗叶发黄，呈鲜黄色，植株矮化不明显，能抽穗，但千粒重减少，根系浅，易拔起。BYDVs寄主范围较广，目前已知至少可以侵染150多种禾本科作物和杂草，其主要寄主作物既包括小麦、玉米和水稻世界三大粮食作物，也包括大麦、燕麦和黑麦等具有较高经济价值的粮食作物。虽然BYDVs寄主范围广泛，但都集中在单子叶植物范围内，在自然条件下尚未发现能够被BYDVs侵染的双子叶植物。根据寄主范围、对寄主的毒性、蚜虫传播特异性与反应类型等特点，Rochow等将美国的BYDVs分为MAV、PAV、RPV、RMV和SGV5个株系。在中国，周广和等筛选鉴定出了4个BYDVs株系，即PAV、RMV、GPV和GAV。BYDVs属黄症病毒科(Luteoviridae)，是一种+ssRNA病毒。病毒粒子由正单链RNA和外壳蛋白组成，呈正二十面体(T＝3)，无包膜。目前，根据国际病毒分类委员会关于病毒的分类，BYDVs分布于黄症病毒科(Luteoviridae)的2个属8个种，且还有2个种未被划分到属。在10个种中，BYDVPAV、BYDVPAS、BYDVMAV、BYDVkerII和BYDVkerIII这5个种属于黄症病毒属(Luteovirus)；原RPV株系被升级为Cerealyellowdwarfvirus-RPV(CYDVRPV)，并和CYDVRPS和MYDVRMV这2个种一起被划分到马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)中；另外，BYDVGPV和BYDVSGV两个种未归类。这些引起大麦黄矮病的各种病毒株系间的核酸同源性非常的低，其实是完全不同的病毒，由于命名的习惯现在还叫大麦黄矮病毒。据统计，全世界至少有25种蚜虫可以传播BYDVs。而在中国，禾谷缢管蚜(R.padi)、麦长管蚜(S.avenae)、麦二叉蚜(S.graminum)和玉米蚜(R.maidis)是BYDVs的主要传播介体。BYDVs在蚜虫体内以循回型非增殖方式传播。目前田间常常根据症状观察判断小麦黄矮病的发生情况，但相比真菌病害和细菌病害，病毒病的症状特点并不明显，常与其他病毒病害相混淆，出现错误判断的情况，而且通过症状并不能判断病毒具体是哪个株系。电镜观察需要昂贵的设备和专业人员，不适合基层应用。RT-PCR等分子生物学方法虽然灵敏度高，但往往受仪器的限制，仅适用于实验室少样品的检测。相比较而言，血清学方法简单易操作、快速、灵敏，成本较低，是目前植物病毒理想的检测手段，但血清学方法必须依赖于特异、灵敏的优质抗体。因此，本专利技术专利主要针对大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的制备及其检测应用开展工作，利用常规杂交瘤技术制备了1株能分泌抗BYDVPAV单抗杂交瘤细胞24G4，并用其分泌的单抗建立了检测该病毒的血清学方法和检测试剂盒，从而为我国大麦黄矮病毒PAV株系的检测、诊断和科学指导防控提供物质和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗的应用。分泌抗大麦黄矮病毒(BYDV)PAV株系单抗杂交瘤细胞株24G4，它能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的特异性单抗,杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13298。抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-9，抗体类型及亚类为IgG1、Kappa链，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染大麦黄矮病毒PAV株系的小麦病叶的灵敏度分别达到1:81920和1:1280倍稀释(w/v,g/mL)。抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体仅与大麦黄矮病毒PAV株系有特异性免疫反应，而与小麦矮缩病毒、中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、大麦黄花叶病毒、大麦黄矮病毒GPV株系和GAV株系以及健康小麦植物组织均不发生任何免疫反应。抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体在大麦黄矮病毒PAV株系检测上的应用是以单抗为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。本专利技术与现有技术相比具有的有益效果：1)提供的杂交瘤细胞株24G4分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA和ACP-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏地检测大麦黄矮病毒PAV株系；2)利用本专利技术所制备的单抗检测大麦黄矮病毒PAV株系，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3)利用本专利技术所制备的单抗可有效地用于田间小麦样品中大麦黄矮病毒PAV株系的检测。附图说明图1是dot-ELISA方法检测小麦BYDVPAV的灵敏度分析；图2是dot-ELISA方法检测BYDVPAV的特异性分析：1列上下2个点为2个感染BYDVPAV的小麦样品，2列上下2个点为2个感染小麦黄花叶病毒的样品，3列上下2个点为2个感染中国小麦花叶病毒的样品，4列上下2个点为2个感染大麦黄矮病毒GAV株系的样品，5列上下2个点为2个感染大麦黄矮病毒GPV株系的样品，6列上下2个点为感染小麦矮缩病毒的样品，7列上下2个点为感染大麦黄花叶病毒的样品，8列上下2个点为健康小麦植物组织样品。图3是dot-ELISA方法检测小麦田间样品中BYDVPAV的代表性结果。生物保藏杂交瘤细胞株24G4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日为2016年11月30日，保藏号为CGMCCNo.13298。具体实施方式分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单抗的杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13298，它能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体。抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-9，抗体类型及亚类为IgG1、Kappa链，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株24G4，其特征在于能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的特异性单抗，杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13298。

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系单克隆抗体的杂交瘤细胞株24G4，其特征在于能分泌抗大麦黄矮病毒PAV株系的特异性单抗，杂交瘤细胞株24G4于2016年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13298。2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株24G4分泌的抗大麦黄矮病毒PAV株系的单克隆抗体，其特征在于该单抗腹水间接ELISA效价达10-9，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链；利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析发现该单抗检测感染大麦黄矮病...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，周雪平，张明皓，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33