本发明专利技术提供一种鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a荧光标记单抗在制备人活化T细胞检测试剂中的应用。所述抗体是一种用异硫氰酸荧光素直接标记的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的荧光抗体（2B8a-FITC）。以该抗体为基础制备的异硫氰酸荧光素标记的荧光抗体对于抗原的结合具有高度的敏感性和特异性，同时活性良好，能识别经植物血凝素刺激的活化T细胞和再生障碍性贫血等免疫相关性疾病病人外周血中的活化T细胞。可应用于人活化T细胞活化状态的检测，可制备成检测试剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物技术，主要涉及鼠免疫球蛋白，尤其涉及活化T细胞检测试剂的开发，即用异硫氰酸荧光素(FITC)直接标记鼠抗人活化T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体(单抗)制备荧光抗体(2B8a-FITC)，在制备人活化T细胞检测试剂中的应用。
技术介绍
T细胞的活化状态对免疫系统的稳定至关重要，正向和负向调控失衡都将引起疾病的发生。如T细胞在再次免疫应答过程中反应过强可以出现超敏反应引起组织损伤；体内存在针对自身抗原的自身反应性T细胞可以导致多发性硬化、胰岛素依赖性糖尿病和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病；抑制性T细胞的功能过亢、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤抗原不能识别或T细胞信号转导的缺陷可以导致肿瘤的发生；T细胞对同种异型抗原的识别是发生移植物抗宿主病(GVHD)的基础。在肿瘤免疫治疗过程中，T细胞的活化状态与疾病的治疗效果密切相关。在儿童血液系统疾病中，再生障碍性贫血(ΑΑ)、噬血细胞综合征(HLH)等疾病的发生均与T细胞的过度活化、功能过亢有关。在ΑΑ，其主要的发病机制是Thl细胞和CD8+T细胞过度增殖活化分泌细胞因子损伤造血干/祖细胞和间充质干细胞(MSC)，同时MSC、调节性T细胞、NK细胞、NKT细胞及早期造血生长因子水平的下降是机体免疫调节和支持造血的能力下降所致。因此，抑制和/或杀伤活化T细胞的免疫抑制疗法是治疗AA的策略。而HLH则是由于自身的免疫缺陷病原体难以清除，导致T细胞过度活化和细胞因子风暴而损伤脏器，该病进展迅速、死亡率非常高，基本的治疗手段也是通过激素、环孢素及依托泊苷等药物抑制或杀灭活化T细胞而使疾病缓解。因此，活化T细胞的检测对于疾病的诊断、鉴别诊断及疗效评估均有重要意义，同时也是医学科学研究过程中常用的手段。T细胞活化分子的表达是T细胞活化的重要标志。T细胞活化分子是在静息T细胞表面弱表达或不表达，而在T细胞受丝裂原或抗原刺激后表达于该细胞表面的分子，包括细胞因子、细胞因子受体、粘附分子、协同刺激分子、MHC分子和细胞毒物质等。由于各分子功能的差异，其在细胞表面的表达时间也有明显差异。如临床上常有的检测指标CD69是一个早期活化的标志，在T细胞活化后12 24h内达到高峰，24h后开始逐渐下降，且其表达并不强；而HLA-DR则是个晚期活化的标志，一般在T细胞活化后72h开始出现。因此，一个早期稳定的T细胞活化分子对于及时了解T细胞状态具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鼠抗人T细胞抗原ZCH_2B8a荧光标记单抗在制备人活化T细胞检测试剂中的应用。 所述抗体是一种用异硫氰酸荧光素(FITC)直接标记的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的荧光抗体(2B8a_FITC)，所述的鼠抗人T细胞抗原ZCH-2B8a单克隆抗体的重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示；轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。本专利技术提供的鼠抗人活化T细胞抗原ZCH_2B8a单克隆抗体是以分化早期的CD34+白血病细胞系KGla作为免疫原，采用经典鼠-鼠杂交瘤技术制备而成。该抗体经递交国际人类白细胞分化抗原协作组会议(8th International Workshop and Conference on HumanLeukocyte Differentiation Antigens, HLDA-8)鉴定后认为该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的造血细胞膜新的分化抗原或新的CD分子。该单克隆抗体重、轻链分别具有SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列分别为SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。研究表明，2B8a抗原在T细胞活化早期(12小时内)即出现表达，并逐渐增强，在72h 96h达高峰，是一个早期稳定的活化标志。当纯化2B8a单抗直接用于流式检测时是采用间接免疫荧光标记法，即需要荧光素标记的羊抗鼠Fe段抗体作为二抗与其结合才能被流式细胞仪检测到，操作步骤比较繁琐，非特异性结合较高。因此，本实验室采用改良Marshall法，用FITC标记纯化的2B8a单抗，制备FITC直接标记的2B8a荧光抗体2B8a_FITC。2B8a_FITC使流式检测步骤简化并且大大减少了非特异性结合，并可以与其他不同荧光素偶合的抗体联合进行多色荧光分析，使不同活化T细胞亚群的分析检测结果更为准确、可靠。本专利技术所述的用FITC直接标记的荧光单抗(2B8a_FITC)的制备方法为:将纯化的2B8a单抗，通过改良Marshall法，用FITC进行标记，多余FITC经PBS充分透析除去。通过检测植物血凝素(PHA)活化的T细胞及再生障碍性贫血(AA)及噬血性淋巴组织细胞增生症(HLH)等免疫学紊乱性疾病患者的外周血T细胞表明，2B8a-FITC与活化T细胞具有良好的识别活性，对T细胞免疫功能的基础研究以及免疫性紊乱性疾病的临床诊断具有重要的应用价值。目前临床上用于检测T细胞活化状态的常用指标是⑶69、⑶25和HLA-DR。⑶69虽然在T细胞活化早期即可出现，但表达时间短，临床检测阳性率低，敏感性差。CD25和HLA-DR虽然持续时间长，但表达较晚，在T细胞活化早期呈阴性。而2B8a的表达规律不同于上述3个抗原(图7)，它表达早且持续稳定，表达强度高，在用于T细胞活化状态的检测上具有更大的优势。因此，我们认为，2B8a-FITC荧光抗体用于活化T细胞的检测较⑶69、⑶25和HLA-DR具有更高的准确性。ZCH-2B8a (简称2B8a)是鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆杂交瘤细胞系，以分化早期的CD34+白血病细胞KGla作为免疫原，采用经典鼠鼠杂交瘤技术制备而成。经三次亚克隆培养，建立了能稳定分泌2B8a抗体的杂交瘤细胞系。该抗体经递交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(8th International Workshop and Conference on HumanLeukocyte Differentiation Antigen, HLDA-8)鉴定后认为该抗体识别的抗原性质不明，属国际上尚未认识的造血细胞膜新的分化抗原或新的CD分子。研究表明，该抗体与正常外周血静止期T细胞不反应，但与活化的T细胞反应较强，可能识别新的活化分子，可应用于人活化T细胞活化状态的检测，可制备成检测试剂。 附图说明图1是鼠抗人活化T细胞新抗原ZCH_2B8a单克隆抗体的可变区重链基因(VH2B8a)序列(两个黑色箭头之间的序列)。序列位置:76_435，共360bp。图2是鼠抗人活化T细胞新抗原ZCH_2B8a单克隆抗体的可变区轻链基因(VL2B8a)序列(两个黑色箭头之间的序列)。序列位置:622_960，共339 bp。图3是SPA Sepharose亲和层析法纯化2B8a抗体腹水色谱图。图4是SDS-PAGE鉴定2B8a抗体蛋白亚基的电泳图。左侧泳道为蛋白分子量标准，右侧泳道为经DTT还原后的2B8a抗体的重链和轻链，分子量分别约为52 kDa和29 kDa。图5是流式细胞术评价2B8a_FITC直标抗体。图6是2B8a本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人T细胞抗原ZCH?2B8a单克隆抗体在制备人活化T细胞检测试剂中的应用，所述的鼠抗人T细胞抗原ZCH?2B8a单克隆抗体的重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.?1所示，轻链可变区基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.?2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤永民，徐晓军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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