本发明专利技术提供了一种重组猪IL2-Fc融合蛋白及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。IL2在疾病发生过程中起到十分重要的免疫调节作用，但其也存在血浆中清除速度较快、产业化成本高的缺陷。为大量获取半衰期较长的猪IL2，本发明专利技术采用大肠杆菌原核表达体系提供了一种重组猪IL2-Fc融合蛋白。其中，猪IL2部分为猪IL2胞外区的全部序列，Fc片段部分包括抗体的铰链区、CH2区和CH3区，猪IL2与Fc片段部分之间为直接融合。本发明专利技术提供的重组猪IL2-Fc融合蛋白，不仅保存了IL-2的大部分生物活性，而且极大的延长了其半衰期，为低成本大量表达及其产业化提供了保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪白细胞介素2-FC融合蛋白及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。
技术介绍
白细胞介素2(Interleukin-2，简称IL-2)是由活化的T淋巴细胞产生的一种重要的细胞因子，能激活T细胞和促进B细胞分化和分泌抗体，诱导产生干扰素，增强单核细胞以及自然杀伤细胞(natural killer cell，简称NK)的杀伤活性，在机体的免疫反应中具有重要的调节作用，是一类天然的免疫增强剂。在医学治疗领域，商品化的重组人白细胞介素2已经用于肿瘤、艾滋病、乙型肝炎等疾病的辅助治疗。在兽药中，由于白细胞介素2能提高疫苗的免疫应答、减少疾病的发生，也展现出广阔的应用前景。目前，对鸡、牛白细胞介素2基因的研究较多，两者均已在原核和真核表达系统中表达。研究显示，鸡的重组白细胞介素2与多种病原疫苗联合使用，可显著提高免疫水平，减少应激，降低疫苗的副作用，从而达到更强的治疗作用。我国是世界上养猪大国，猪的疾病种类繁多，特别是病毒性传染病造成的发病率和死亡率最高，每年给养猪业造成巨大的经济损失，因此对这些病毒性疾病的治疗和预防成为养猪业的首要任务。白细胞介素2增强免疫、抵御病毒的性质使得其在猪的病毒性疾病方面显示出广阔的应用前景，但是针对猪白细胞介素2的研究却并不多见。另一方面,作为小分子量蛋白，猪白细胞介素2也与其他白细胞介素2 —样,存在血浆清除速度较快的缺陷，从 而导致在临床治疗中需要重复多次用药才能达到治疗效果。同样，半衰期短及用药的频繁也将成为使用猪白细胞介素2治疗猪病毒性疾病的瓶颈。IgG免疫球蛋白是人和动物体内的主要抗体，它在体内的半衰期约为20天。其稳定性是由于IgG的Fe片段可与新生Fe受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。由此可见，可以考虑在猪白细胞介素2上增加IgG的Fe片段来构成融合蛋白，以提高猪白细胞介素2体内半衰期，达到长效的目的。由此，本专利技术提供一种既能保留猪白细胞介素2原有活性，又可以延长体内半衰期的猪白细胞介素2与Fe片段的融合蛋白。然而，通过大肠杆菌表达的重组蛋白多为不溶解、无活性的细胞内聚集物，即包涵体。包涵体的复性是一个非常复杂的过程，如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，一方面降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又产生沉淀析出，影响得率。因此，本专利技术所要解决的另一个技术问题是采用合适的方法将大肠杆菌表达的蛋白包涵体进行复性。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白以及其基因和表达、纯化、复性方法。本专利技术提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包括猪白细胞介素2部分和Fe片段部分，其中，猪白细胞介素2部分为猪白细胞介素2胞外区的全部序列，Fe片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪白细胞介素2与Fe片段部分之间为直接融合。其中的Fe片段选自人或动物的免疫球蛋白Fe，是Fe全长或是部分序列，Fe选自IgG、IgM、IgD、IgA,每种免疫球蛋白类型包括各亚型,如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。本专利技术的融合蛋白中的Fe片段部分特别优选来自猪的IgGl。优选地，本专利技术的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中第1-134位氨基酸残基为猪白细胞介素2的胞外区序列，第135-334位氨基酸残基为猪IgGl序列。本专利技术提供了编码上述所述重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQID NO:1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达。 本专利技术还提供了包含了上述所述编码重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的基因的质粒，所述的质粒优选为原核表达质粒，最优选为pET21b载体。本专利技术还提供了包含有上述所述质粒的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。本专利技术还提供了重组猪白细胞介素2-FC融合蛋白在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤:该方法的步骤为:1.挑取I个或多个含有上述所述重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的大肠杆菌菌落，接入LB培养液，于37 °C培养过夜；2.取适量过夜培养物，接入于所述过夜培养物的100倍量的LB培养液中，于37°C震荡培养至对数中期0D_=1.0 ；3.在培养物中加入IPTG至lmmol/L，于37°C，诱导表达4h后，于4°C以转速5000rpm,离心处理15min,收集含有重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白的大肠杆菌菌体。所述LB培养液中均含有氨苄青霉素50-100 μ g/ml。本专利技术的上述所述表达方法是经过专利技术人反复多次实验摸索和验证得到的用于表达重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性后活性更高。本专利技术还提供了重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的包涵体纯化方法，包括如下步骤:1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4°C高速离心处理；重复一次。2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液Buffer A3_10mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。3.每克(湿重)菌体加入3-10yL浓度为100mmol/L的PMSF，3-100yL浓度为100mg/mL的溶菌酶，于冰上搅动。4.破碎菌体，样品置于冰上，超声，并于4°C高速离心处理。5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，并于4°C高速离心处理，沉淀包涵体，重复一次。6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30_60min。7.充分混匀后室温高速离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶液。该纯化方法优选步骤如下:1.将收集得到的上述含有诱导重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白大肠杆菌沉淀，用预冷的PBS重悬，于4°C，以12000rpm的转速离心15min ;重复一次。2.吸去上清，称菌体沉淀重量，每克(湿重)加入裂解缓冲液Buffer A5mL，用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。3.每克(湿重) 菌体加入5μ L浓度为100mmol/L的PMSF，5y L浓度为100mg/mL的溶菌酶，冰上搅动20min。4.用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min,等待样品冷却。于4°C,以12000rpm的转速离心15min,弃上清。5.沉淀用洗漆缓冲液Buffer B洗漆,于4 ,以12000rpm的转速离心15min,沉淀包涵体，重复一次。6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。7.充分混匀后室温下以12000rpm的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白变性溶液。本专利技术还提供了优化后的重组猪白细胞介素2-Fc融合蛋白的包涵体复性方法，包括如下步骤:取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的重组猪白细胞介素2_Fc融合蛋白变性溶液，用复性缓冲液Buff本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组猪白细胞介素2‐Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括猪白细胞介素2部分和Fc片段部分，所述猪白细胞介素2部分为猪白细胞介素2胞外区的全部序列，所述Fc片段部分包括铰链区、CH2区和CH3区，猪白细胞介素2与Fc片段部分之间为直接融合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马永，王安良，章成昌，徐春林，陈晨，王耀方，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，常州京森生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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