本发明专利技术提供了一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其包含人激活蛋白-1的抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。本发明专利技术还提供该融合蛋白的制备方法。经基因工程策略获得本发明专利技术所述的重组融合蛋白后对其进行体外抗瘤作用检测显示，能在细胞和动物水平有效抑制肿瘤的生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术、生物药物领域，具体地，本专利技术涉及人强效抑制剂SARI (Suppressor of AP-1, Regulated by IFN)蛋白和 B 细胞激活因子(B cellactivating factor belonging to the TNF family, BAFF)的突变后的蛋白 msBAFF 组成的抗恶性淋巴瘤融合分子，及其制备方法。
技术介绍
恶性淋巴瘤严重威胁人类生命健康。迄今为止，用于治疗这些疾病的主要方法仍是放疗、化疗，但放疗、化疗同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞，毒副作用极大。肿瘤的生物治疗是一个充满希望的研究领域，它对克服肿瘤治疗中的毒副作用，提高治疗效率具有不可忽视的作用。近年来，有关AP-1和BAFF的研究为这一目标的实现提供了新的途径。激活蛋白-1 (activator protein-1, AP-1)是生物体中细胞核内重要的转录因子，参与靶基因调节。AP-1在包括恶性淋巴瘤在内的90%以上的肿瘤细胞中过度表达，是C-MYC、MMPU MMP3、TNF、TSG6等多种肿瘤相关基因的转录调控因子。调控上述多种基因的表达，对细胞的增殖、浸润转移、凋亡及转化、免疫调节、分化方面起着重要作用，在肿瘤发生发展的基因活动网络中具有关键作用。因此，AP-1的活化与肿瘤密切相关，被认为是进行肿瘤治疗的重要新靶标。最新研究发现，AP-1的强效抑制剂SARI (SuppressorofAP-1, Regulated by IFN)只选择性诱导肿瘤或表型转化细胞凋亡，而不杀伤人类正常细胞亦无毒副作用。BAFF (B cell activating factor belonging to the TNF family)是 TNF 家族成员，有膜结合型和可溶性两种形式，二者的生物学活性基本一致。人BAFF全长为285个氨基酸。近年研究表明，BAFF过表达与恶性淋巴瘤的发生密切相关。在人天然BAFF中，217-224八个氨基酸对该分子活化淋巴细胞至关重要，已有实验证实这八个氨基酸残基被两个甘氨酸残基替换后所得到的BAFF突变体(msBAFF)只能结合BAFF受体，而不能活化淋巴细胞。此突变体在体内可竞争与受体的结合，从而阻断BAFF的生物学活性，抑制淋巴细胞的活化与增殖，因而目前已开始考虑用其作为治疗BAFF相关疾病的竞争性抑制剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其包含人激活蛋白-1的抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。所述抗恶性淋巴瘤融合蛋白，优选地，在所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI和突变蛋白msBAFF之间连接有TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。所述TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD的编码序列优选为SEQ ID NO:6所示的序列。本专利技术所述的抗恶性淋巴瘤融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述融合蛋白的编码序列如SEQ ID N0:2所示。本专利技术还提供上述的重组融合蛋白的制备方法，主要包含以下步骤:I)提取人外周血单核细胞的总RNA并将其反转录为cDNA ；2)以步骤I)中的cDNA为模板，使用SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列为引物扩增人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA ；3)将步骤2)所得的人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA及含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体酶切后连接，构建含所述人激活蛋白_1的抑制剂SARI基因片段和所述突变蛋白msBAFF的基因片段的重组质粒；其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体；4)将步骤3)获得的重组质粒转化大肠杆菌，诱导表达获得所述重组融合蛋白。其中，步骤3)所述含有人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF的基因片段的载体优选为pET28a-G4S-9R-G4S-mBAFF，其中G4S为4个甘氨酸和一个丝氨酸组成的柔性接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；9R为TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。其中，步骤4)所述大肠杆菌优选为BL21Rossetta菌株。经基因工程策略所获得的本专利技术所述的重组融合蛋白后对其进行体外抗癌作用检测显示，能有效抑制淋巴瘤的生长。鉴于msBAFF所具有的良好靶向性和竞争抑制作用，并基于SARI安全有效的抗瘤作用，将msBAFF和SARI融合在一起，并在两个分子之间引入具有膜转位作用的多肽TAT-PTD，以msBAFF蛋白作为靶向载体运送SARI蛋白转位至细胞内，进而与细胞核内的AP-1结合来治疗恶性淋巴瘤，可达到高`效、安全、特异的抗瘤目的。本专利技术借助基因工程的策略构建由均具有明显抗癌效应的SARI和恶性B细胞特异靶向分子msBAFF组成的融合分子，其优点在于:(1)现有研究已经证实SARI在多种肿瘤细胞中低表达或不表达，而在对应的正常细胞中高表达，将SARI高表达后可明显抑制多种肿瘤的增殖与发展。因此，SARI具有很好的肿瘤治疗应用前景；(2)msBAFF是人BAFF的突变体，可与其受体结合，但不产生受体后效应，而恶性B细胞系白血病的细胞表面有大量的BAFF受体表达，因此msBAFF可作为一种理想的特异性靶向分子；(3)G4S为4个甘氨酸与I个丝氨酸相连组成的柔性接头，专利技术人通过实验已经证实G4S可显著提高融合蛋白的细胞毒性；(4 )9R为9个精氨酸残基，为穿膜肽主要成分，可显著提高融合蛋白的内吞效应；(5 )pET28a/Rossetta系统是专利技术人通过筛选而优化的优选表达体系，具有表达稳定、表达量高等诸多优点，且获得带有6XHis标签肽的目的蛋白，易于纯化，大大提高了融合蛋白的产率。为让本专利技术的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。附图说明图1为pET28a质粒图谱；图2 为融合基因 SAR1-G4S-9R-G4S-mBAFF (SGRB)测序图谱；图3A-图3C为蛋白质免疫印迹图谱，其中，图3A中1_2为Rossetta/pET-SGRB重组菌IPTG诱导后表达产物(箭头指示处)；3为Rossetta/pET28a重组菌IPTG诱导后表达产物；4为Rossetta菌株IPTG诱导后表达产物；5为低分子量蛋白marker ;图3B中I为低分子量蛋白marker ；2为Rossetta/pET_SGRB重组菌IPTG诱导后的SGRB包涵体；图3C为Rossetta/pET-SGRB 重组菌 IPTG 诱导 SGRB 表达产物经 Western blot 分析；图4A-图4C为激光共聚焦检测SGRB在白血病细胞的定位分布，其中，图A为Raji细胞；图B为Namalwa细胞；图C为Jeko细胞；图5A-图5C为流式细胞仪检测SGRB对白血病细胞的杀伤效应，其中，图A为Raji细胞；图B为Namalwa细胞；图C为Jeko细胞；图6A-图6C为SGRB处理后裸鼠动物模型的肝脏切片图谱，其中，图6A为未注射Raji细胞的正常裸鼠肝脏组织；图6B为注射Raji细胞的裸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其特征在于，包含人激活蛋白?1的抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217?224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。
【技术特征摘要】
1.一种抗恶性淋巴瘤融合蛋白，其特征在于，包含人激活蛋白-1的抑制剂SARI和人B细胞激活因子BAFF的突变蛋白msBAFF，其中msBAFF是人B细胞激活因子BAFF的217-224位氨基酸被2个甘氨酸取代后的突变体。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人激活蛋白-1的抑制剂SARI和突变蛋白msBAFF之间连接有TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD。3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述TAT蛋白转导结构域多肽TAT-PTD的编码序列如SEQ ID N0:6所示。4.如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的编码序列如SEQIDNO:2所示。6.如权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包含步骤: 1)提取人外周血单核细胞的总RNA并将其反转录为cDNA； 2)以步骤I)中的cDNA为模板，使用SEQID NO:3_4所示的核苷酸序列为引物扩增人激活蛋白-1的抑制剂SARI的cDNA ； 3)将以步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：何凤田，张立，杨朝辉，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：
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