体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物制造技术

本发明专利技术公开了含有生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽，所述生物活性蛋白质偶联物显示的血浆半衰期与未偶联生物活性多肽或蛋白质的固有半衰期相比有所改变。本发明专利技术也公开了制备和应用偶联蛋白的方法，以及确定某给定偶联物的半衰期相对于未偶联多肽的固有半衰期是否改变的方法。

【技术实现步骤摘要】
体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物本专利技术专利申请是国际申请号为PCT/US2006/002501，国际申请日为2006年I月25日，进入中国国家阶段的申请号为200680002871.0，名称为“体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉参考根据35U.S.C119(e)，本申请要求2005年8月30日提交的美国申请号60/712，585和2005年I月25日提交的美国申请号60/647，119的优先权，纳入其内容作为参考。
本专利技术总地涉及生物活性蛋白质，更具体涉及改变生物活性蛋白质的半衰期。序列表根据37C.F.R.§ § 1.821 (C)和1.52 (e)，本申请含有冗长的序列表，通过⑶-R代替打印纸件提交此序列表。2006年6月30日刻录的所述⑶-R分别标记为CRF, Copyl、 Copy2和Copy3。各自仅含有一个相同的 2.3MB 文件(CELTH349.APP)。将含有序列表的⑶-R的内容纳入本文作参考(37C.F.R.§ 1.52(e) (5)).
技术介绍
作为人类治疗药物给予时，生物活性蛋白质的半衰期常常不理想。它们的固有半衰期使得给药方案和剂量方案常常达不到最优治疗效果，产生顺从性问题和使患者不方便。 在用于人类治疗的生物活性蛋白质生产中，曾尝试通过物理方法(如改变给药途径、纳米颗粒包装和脂质体包裹)、化学修饰(如乳化、PEG化和超糖基化)和遗传修饰(如修饰蛋白质一级结构，聚合物标记、人血清白蛋白融合、掺入翻译后修饰)延长生物活性蛋白质的半衰期。参见例如，Lord 等，Clin.Cancer Res.7:2085-2090 (2001)和 van DerAuwera等,Am.J.Hematol.66:245-251 (2001)。然而,这些方法会产生其它问题。通过物理方法延长生物活性蛋白质半衰期常常使药物复杂性增加，在制造过程中增加了成本高和耗时的下游加工。化学修饰可能改变生物活性蛋白质的生物学活性或安全性。通过重组DNA合成法制备生物活性蛋白质时，需要根据具体应用在特定的细胞表达系统中评估遗传修饰对蛋白质产率和纯度的影响。因此，需要改变生物活性蛋白质的固有半衰期的其它方法。
技术实现思路
本专利技术一方面涉及包含生物活性多肽的蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽(氨基酸延伸物)。该基序包含主要组件和次要组件，其中主要组件是两个或多个Asn (N)残基，次要组件是选自Ser(S)和Thr (T)的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是:没有一种氨基酸同时存在于主要组件和次要组件中，与未偶联的生物活性多肽的固有半衰期相比，该偶联物的血浆半衰期有所延长。术语固有半衰期指天然生物活性多肽的半衰期或未偶联形式(因此包括重组形式的天然多肽)多肽的半衰期。在一些实施方式中，所述肽基序包含3-6个氨基酸残基(即3、4、5或6个)。在一些实施方式中，所述肽基序含有5或6个氨基酸残基,次要组件包含所述肽的I个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述氨基酸延伸是在所述生物活性多肽的N-末端；在一些实施方式中，是在所述生物活性多肽的C末端；在其它实施方式中，延伸位于所述生物活性多肽的N和C-末端。在一些实施方式中，所述生物活性多肽是细胞因子(如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素或干扰素、如β-干扰素或Y-干扰素)、抗体、抗体片段、蛋白水解抗体片段或结构域、单链抗体、遗传或化学优化的抗体或其片段、可溶性gpl20或gpl60糖蛋白、凝血因子、可溶性受体如肿瘤坏死因子(TNF)-Ci II型受体、治疗酶或红细胞生成素(EPO)。本专利技术另一方面涉及含有蛋白质偶联物和载体的组合物。在一些实施方式中，所述组合物是药物组合物，所述载体是药学上可接受的载体。本专利技术另一方面涉及编码上述蛋白质偶联物的嵌合DNA分子和含该嵌合DNA分子的载体，以及用该嵌合DNA分子或含有该嵌合DNA分子的载体转化的细胞。在一些实施方式中，所述载体是质粒，如pCE2。在一些实施方式中,所述细胞是哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或者是细菌如大肠杆菌(E.coli)，或酵母。本专利技术另一方面涉及制备包含生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物的方法，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个含主要组件和次要组件的肽单元的多肽，所述主要组件是两个或多个Asn (N)残基，次要组件是选自Ser(S)和Thr (T)的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是:没有一种氨基酸同时存在于所述主要组件和所述次要组件中，因而与未偶联的生物活性多肽的固有半衰期相比，所述生物活性蛋白质的血浆半衰期有所延长，所述方法包括:在表达编码所述蛋白质偶联物的嵌合DNA分子的条件下培养用所述DNA分子转化的细胞，从而产生所述蛋白质偶联物；和从所述细胞中提取所述嵌合DNA分子的表达产物。本专利技术另一方面涉及测定某给定蛋白质偶联物的血浆半衰期相对于未偶联生物活性多肽的固有半衰期是否延长的方法，所述方法包括:a)制备包含生物活性多肽的蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶`联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽，所述基序包含主要组件和次要组件，其中主要组件包含两个或多个Asn (N)残基或由其组成，次要组件包含选自Ser(S)和Thr (T)的一种氨基酸的一个或多个残基或由其组成，没有一种氨基酸同时存在于所述主要组件和所述次要组件中，和b)检测该蛋白质偶联物以确定该蛋白质偶联物的血浆半衰期相对于未偶联生物活性多肽的固有半衰期是否延长。附图说明图1是PHO X pBSK载体的示意图。图2 是 PHO-G-CSF-NN x pBSK 载体的示意图。图3 是 PH0-G-CSF-NNT65x pBSK 载体的示意图(NNT65 如 SEQ ID NO:1 所述)。图4 是 PH0-G-CSF-NNT155x pBSK 载体的示意图(NNT155 如 SEQ ID NO:2 所述)。图5 是 PH0-G-CSF-NNT155x pCE2 载体的示意图(NNT155 如 SEQ ID NO:2 所述)。图6是几种不同G-CSF-多肽偶联物和未偶联G-CSF的Western印迹，NNT65、NNT155 和 NNNNNTNN61 分别如 SEQ ID NO:1_3 所述。图7是电泳前用PNG酶F处理的几种不同G-CSF-多肽偶联物和未偶联G-CSF的Western 印迹，NNT65、NNT155 和 NNNNNTNN61 分别如 SEQ ID NO:1_3 所述。图8是用PR0CH04-CDM培养基培养的CHOKl细胞中表达的G_CSF_NNT155 (NNT155如 SEQ ID NO:2 所述)和 G-CSF-NNT65 (NNT65 如 SEQ ID NO:1 所述)构建物(一式两份)的Western印迹。具体实施方式本文所用术语多肽指没有特定长度的氨基酸聚合物，除非另有说明。因此，多肽的定义包括肽和蛋白质，在本说明书、以及权利要求书中，可互换使用这些术语。术语多肽不排除翻译后修饰，如具有共价连接的糖基、乙酰基、磷酸基团、脂质基团、脯氨酸或赖氨酸羟基化等的多肽。多肽的定义本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物，所述生物活性多肽选自细胞因子、趋化因子、淋巴因子、配体、受体、激素、凋亡诱导多肽、酶、抗体、蛋白水解抗体片段、抗原特异性抗体片段和生长因子，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至250个重复单元的肽基序的多肽，其中，所述基序含有两个Asn（N）残基和一个选自Ser（S）和Thr（T）的氨基酸残基，因而与未修饰的生物活性多肽的血浆半衰期相比，该生物活性蛋白质偶联物的血浆半衰期延长。

【技术特征摘要】
2005.01.25 US 60/647,119;2005.08.30 US 60/712,5851.一种含有生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物，所述生物活性多肽选自细胞因子、趋化因子、淋巴因子、配体、受体、激素、凋亡诱导多肽、酶、抗体、蛋白水解抗体片段、抗原特异性抗体片段和生长因子，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至250个重复单元的肽基序的多肽，其中，所述基序含有两个Asn (N)残基和一个选自Ser (S)和Thr(T)的氨基酸残基，因而与未修饰的生物活性多肽的血浆半衰期相比，该生物活性蛋白质偶联物的血浆半衰期延长。2.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述肽基序具有由NNS或NNT组成的序列。3.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述含有重复单元的肽基序的多肽是所述生物活性多肽的N末端、C末端、或N末端和C末端。4.如权利要求1所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述生物活性多肽是细胞因子。5.如权利要求4所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述细胞因子是干扰素或生长因子。6.如权利要求5所述的生物活性蛋白质偶联物，其特征在于，所述生长因子选自:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·贝斯曼，S·齐普曼，D·里昂，J·辛格，
申请(专利权)人：细胞治疗学公司，
类型：发明
国别省市：