三聚体Fc融合蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术关于新颖的Fc融合蛋白，包含稳定融合蛋白的三聚体结构之新颖胶原蛋白基序。可溶性结合区域的寡聚合作用可作为改善标靶结合强度及有效地增加疗效，与降低剂量疗程。本案亦公开包含TNF受体家族的成员之医药组合物及其应用于急性及慢性免疫疾病的用途，例如风湿性关节炎。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术关于新颖的三聚体(trimeriC)FC融合蛋白，特别是关于具有稳定三聚体Fe融合蛋白结构的新颖胶原蛋白基序之新颖Fe融合蛋白。
技术介绍
肿瘤坏死因子(TNF-α)为发炎反应的关键调节物，已知涉及多种疾病状态，例如类风湿性关节炎、发炎性肠炎、干癣性关节炎、血管炎、僵直性脊椎炎、及慢性幼年型关节炎等。TNF-α以相似的同质三聚体蛋白存在，每一亚基(subunit)由巨噬细胞及单核球的免疫系统的细胞起始转录翻译为26kDa的第II型跨膜前驱蛋白。在经由TNF-α转变酶(TNF-a converting enzyme ;TACE)将TNF-a跨膜区域远程的位置分解后，释放出TNF-a可溶性三聚体(17kD)，并藉由结合至效应细胞上的两个结构不同的第I型及第II型TNF-a受体(TNFRI及TNFRII)以发挥其活性。跨膜(transmembrane) TNF-a在传递讯息上扮演双重角色，可作为配体及细胞受体。因此跨膜TNF-a在细胞与细胞接触的局部发炎作用中扮演重要角色。抗TNF-a剂,包括infliximab、adalimumab、etanercept及certolizumab pegol,结合于跨膜TNF-α转染细胞的跨膜TNF-α，结合的亲和力较可溶型TNF- α 的亲和力差(Kaymakcalan, Sakorafas et al.2009)。先前报道指出 infliximab、adalimumab 及 etanercept 皆结合于 TNF- α 产出细胞的跨膜 TNF- a , infliximab 及adalimumab单株抗体似乎透过跨膜TNF-α传递较强的抑制信号(Nesbitt, Fossatiet al.2007) 0这些拮抗物对跨膜TNF-α的结合效应不同，在临床上可能造成不同结果(Taylor2010)。与抗TNF-α抗体不同的是，etanerc印t临床上对肉芽肿疾病的发病并不有效，其中跨膜 TNF-α 可能扮演关键角色(Mitoma, Horiuchi et al.2008)。Etanercept 为二聚体分子，由TNF- α受体2 (p75TNF受体)的细胞外区域及人类IgGl的Fe片段所组成。目前被使用在风湿性关节炎的治疗。然而，25%至28%的患者对此治疗没有反应，怀疑可能是因为此蛋白质与TNF-α的亲和力不足。双价的etanercept分子与TNF-a三聚体形成1:1复合体时，TNF-a上的三 个受体结合位，其中两个被etanerc印t占据，但第三个受体结合位为开放(Scallon, Cai et al.2002) 表达结合etanercept的跨膜TNF-α的细胞在体外不被胞解(Iysis),不论补体存在或不存在(Ar or a, Padaki et al.2009)。先前的报道显示etanercept相较于infliximab对跨膜TNF-α展现相对较差的亲和力。专利技术人等假设透过高亲和力的TNF-α结合剂(例如^即町或抗了即^抗体infliximab)造成的细胞自灭(apoptosis)的诱导是因为跨膜TNF-α的接合(ligation),而不是因为分泌的TNF-α被中和，此可作为单核细胞的存活因子。因此促使双价的etanerc印t与跨膜TNF-α的结合强度可能是增加风湿性关节炎及克罗恩氏病(Crohn’ s disease)治疗效果的解决之道。功能性的亲和力(总结合力(avidity))是抗原与多种抗原决定子(antigenicdeterminant)及多价抗体的整体结合强度的测量。抗原结合对象的聚合作用大幅地增加在非常接近目标细胞时结合于专一的相同配体群的效应(或价数)。TNF-α家族受体在结合至其同族的配体时，形成同质的三聚体。可溶型嵌合受体的寡聚合作用在与配体的亲和性上的效应已被研究。美国专利公开案US2005/0255547记载最佳的结果如预期地不是与三聚体的结合，而是与五聚体的结合。三聚体的结合效果与二聚体相似，但是却低于五聚体的结合效果的五倍。使用三聚体聚合区域使异质的标靶结合区域三价聚合已有报道。三聚体聚合区域，例如原骨胶原蛋白(procollagen)的C-前肽(propeptide)、胶原凝集素(collectin)家族蛋白质的螺旋颈区域(coiled-coil neck domain)、FasL及卩遼菌体T4的fibririn三聚体聚合区域(foldon domain)的C端部分(Holler,Kataoka etal.2000)。标祀结合区域可为蛋白质荷尔蒙、细胞激素、淋巴细胞激素(Iymphokine)、生长激素、凝集素(lectin)、酶及可溶性受体片段；或黏结分子，例如选凝素(selectin)及整合素(integrin)。可自我三聚体聚合及从C端或N端方向传送异质融合蛋白的短链α-螺旋胶原蛋白状的肽也已被欧洲专利ΕΡ1798240Β1报道。与免疫球蛋白G(IgG)分子相比，这些三聚体融合蛋白在医疗的应用上有下列缺点:(I)下游步骤:不像IgG分子可轻易地由亲和性层析法在蛋白质A或G共轭的树脂中经结合于IgG的Fe片段而纯化，使得在纯化流程的第I步骤就获得超过98%的均质产物，上述三聚体融合蛋白用于医疗应用的纯化是具挑战性的工作，因为没有商业上可获得的亲和性柱；以及(2)低血清半衰期。因此，三聚体融合蛋白仍有改良的需求，以增加血浆中半衰期及药物动力，以及容易被纯化而应用于医疗用途。
技术实现思路
本案提供一种三聚体融合蛋白，包含三条多肽(polypetides),每一多肽由N端向C端依序融合一结合区域、一胶原蛋白区域及一 Fe区域所构成，其中该胶原蛋白区域包括由(GPP)重复单元及GXKGE (D)基序所构成的多肽。本案更提供一种六聚体融合蛋白，由上述的三聚体融合蛋白经二聚体聚合(dimerization)所形成 。本案再提供一种治疗与TNF-α相关的疾病之医药组合物，包括至少一种的上述三聚体融合蛋白及六聚体融合蛋白。附图说明第IA图显示本案所述之三聚体融合蛋白之示意图；第IB图显示本案所述之六聚体融合蛋白之示意图；第IC图显示实施例1构建的融合蛋白的不同形式的示意图，形式A表示EnbCSFc ；形式 B 表示 EnbhFcCS6 ;形式 C 表示 EnbCS4hFc、EnbCS5hFc 及 EnbCS6hFc ;形式 D:表示EnbCS6hFcM ;及形式 E 表示 bGalCS6hFc ;及第ID图显示etanercept的结构示意图。第2A 2D图显示以蛋白A柱层析法自培养基中纯化的Fe融合分子的结构特征。第2A图显示Etanercept及EnbCS6hFc在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在75°C处理10分钟。第2B图显示EnbCS6hFc在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在室温处理10分钟。第2C图显示EnbCS6hFcM在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在75 °C处理10分钟。第2D图显示bGalCS6hFc在非还原状态及还原状态的电泳结果，样品以50mM的DTT在75 °C处理10分钟。第2A 2D图的所有样品以相同量的蛋白质在4 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三聚体融合蛋白，包含三条多肽，每一多肽由N端向C端依次融合一结合区域、一胶原蛋白区域及一Fc区域所构成，其中该胶原蛋白区域包括由三联体(GPP)重复单元及GXKGE(D)基序所构成的多肽氨基酸序列，X表示任意氨基酸。

【技术特征摘要】
2011.12.26 TW 1001485441.一种三聚体融合蛋白，包含三条多肽，每一多肽由N端向C端依次融合一结合区域、一胶原蛋白区域及一Fe区域所构成，其中该胶原蛋白区域包括由三联体(GPP)重复单元及GXKGE(D)基序所构成的多肽氨基酸序列，X表示任意氨基酸。2.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该胶原蛋白区域包括(GPP)n-GXKGE(D)基序- (GPP) m所示之氨基酸序列，η及m表示5或以上的整数。3.如权利要求2所述的三聚体融合蛋白，其中该η表示5或6,m表示6。4.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该GXKGE(D)基序包括由氨基酸序列GEKGEKGDPGPKGDP 或 GEKGEKGDPGPKGDI 所构成。5.如权利要求1所述的三聚体融合蛋白，其中该结合区域由受体或抗体所构成。6.如权利要求5所述的三聚体融合蛋白，其中该受体包括TNF-α受体。7.如权利要求1所述的三聚体融...

【专利技术属性】
技术研发人员：周民元，邱伟钧，赖雅萍，
申请(专利权)人：财团法人工业技术研究院，
类型：发明
国别省市：