位点特异性蛋白质偶联物的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种快速有效的制备蛋白质-聚合物偶联物，包括胰 岛素-聚合物偶联物的一步方法。根据本发明专利技术的方法，蛋白质和亲水 聚合物在至少一种有机溶剂和至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋 白质和聚合物形成偶联物的条件下接触。因此本发明专利技术涉及用聚乙二醇 在PheB1残基上对特定的蛋白质，例如胰岛素，进行位点特异性修饰。 本发明专利技术还提供一种将偶联物包封在生物可降解的聚合物中的药物制 剂。

【技术实现步骤摘要】
位点特异性蛋白质偶联物的制备方法本申请是国际申请日为2004年4月8日的国际申请PCT/US2004/010995进入中国、申请号为200480009722.8的题为“位点特异性蛋白质偶联物的制备方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请本申请要求美国临时申请号为60/462364，申请日为2003年4月11日的专利申请的优先权，并将其全部内容作为本申请的参考。
本专利技术涉及比非偶联的蛋白质具有更优良性质的化学修饰的蛋白质偶联物(conjugate)。特别的是，本专利技术涉及一种大为简化的、节约成本的并可扩大规模的以亲水聚合物修饰蛋白质的方法。更特别的是，本专利技术涉及用聚乙二醇进行位点特异性修饰特定的蛋白质，例如胰岛素。本专利技术还涉及基于生物可降解聚合物的药物递送制剂，其包含了经亲水性蛋白质位点特异性修饰的蛋白质。
技术介绍
许多生产PEG化的胰岛素衍生物的方法都是已知的。Davis等(美国专利No.4179337)中记载了应用三氯-s-三嗪(氰尿酰氯)作为PEG和蛋白质之间的连接物，合成一种PEG-胰岛素构建物。在他们的合成路线中，大量过量(50×)的氰尿酰氯活化的PEG(2000Da)与胰岛素在硼酸盐缓冲液(pH9.2)中反应2小时。专利技术人能够制备部分(～50％)有活性的非免疫源的和非抗原的PEG-胰岛素偶联物。Obermeier等(加拿大专利No.1156217)发现根据上述Davis的专利中实施例X制备PEG-胰岛素偶联物时产生了一种不均一的偶联物混合物，其中包含约50％三-PEG-胰岛素偶联物，以及其它在PheB1残基上未取代的可能的PEG-胰岛素衍生物的组合(单和二-PEG-胰岛素)。Obermeier等(加拿大专利No.1156217)阐述了一种在PheB1残基上特异性修饰的PEG-胰岛素偶联物的合成。他们的专利技术的主要内容涉及在碱性条件下的有机溶剂(例如DMF、DMSO、吡啶等)中，用四丁基氧羰基(t-boc)或甲基磺酰乙氧羰基(Msc)保护GlyA1和LysB29残基上的反应性胺。利用常规的色谱技术，从(单、二和三)保护的胰岛素的复合混合物中分离出NαA1，NεB29-双保护的胰岛素种类。分离后，纯的NαA1，NεB29-双保护的胰岛素与一种活化(盐酸或异氰酸酯)的PEG衍生物反应，随后利用肽化学常用技术除去保护基团。专利技术人发现GlyA1和LysB29上的氨基在碱性条件下比PheB1的氨基的反应性强。他们认为他们的位点特异性mPEG(1500)-B1-胰岛素偶联物在降低兔血糖水平时具有100％的胰岛素活性(根据摩尔数计算)。Geiger等(参见D.Branderburg和A.Wollmer(eds.)，Insulin：Chemistry，Structure，andFunctionofInsulinandRelatedHormones，WalterdeGruyter&Co.，NewYork，pp.409-415，1980)和Ehrat等(Biopolymers，22，569-573，1983)描述了利用与Obermeier等描述的多步骤方法相似的一种保护/偶联/去保护方法制备的在PheB1残基上特异性修饰的PEG-胰岛素加成物。Geiger等和Ehrat等发现PEG(1500)-B1-胰岛素偶联物比原来的胰岛素抗原性小得多，稳定得多(对于肝酶)。其它的PEG-胰岛素制剂(Caliceti等，STPPharmaSci，9，107-113，1999；Uchio等AdvancedDrugDeliveryReviews，35，289-306，1999；Hinds等，Bioconj.Chem.11，195-201，2000；Hinds等，AdvancedDrugDeliveryReviews，54：505-530，2002)是1)将重点放在上述基本的三步保护/偶联/去保护方法，2)导致胰岛素分子的非特异性修饰，或者3)不产生最有效的偶联物，其称之为PEG-B1-胰岛素。Liu等(美国专利No.6323311B1)描述了一种有效的合成PEG-B1-胰岛素偶联物的方法。该方法是Obermeier三步保护/偶联/去保护方法的扩展，但是不需要分离步骤之间反应中间产物(即一锅合成)。这样，胰岛素在GlyA1和LysB29残基上保护，立即与PEG反应，随后在任何种类的分离前去保护。专利技术人宣称他们的一锅反应可以生产高达50％的正确位置的异构体(即PEG-B1-胰岛素)，30％未反应的胰岛素能够循环用于随后的衍生化。如果迅速进行制备这些构建物，需要至少五天完成。此外，该专利技术需要大量过量的PEG反应物来达到可接受的结果。虽然该专利技术的产物可能是有效的，它们的制备仍然需要蛋白质在不利于蛋白质的环境(高和低pH)中长时间经历三个反应步骤。通过提供一种一步反应简便地制备在胰岛素B链(PheB1)的氮末端特异性PEG化的高纯度胰岛素衍生物的方法，本专利技术克服了现有技术中PEG化胰岛素方法的缺点。与表明在PheB1的PEG化是可能性最小的反应产物的现有技术(例如Caliceti等，1999，supra)相比，本专利技术的方法采用了特定的控制pH条件，使用金属离子鳌合剂以及加入有机溶剂加强PheB1氨基末端的相对反应性，使之成为PEG化的主要位点。基于通过在PheB1残基上位点特异性PEG化赋予胰岛素的大量有益性质(例如降低的免疫源性/抗原性；提高的蛋白水解、化学和物理稳定性；提高的循环半衰期；提高的水/有机溶剂溶解性；完整的生物活性)，一种实现上述成果的简便的、节约成本的、可简便升级的方法成为本领域中一项显著的进步。
技术实现思路
本专利技术是基于一步制备蛋白质-聚合物偶联物的方法的发现。本专利技术还涉及基于生物可降解的聚合物的药物递送制剂，其包括具有用亲水性蛋白质位点特异性修饰的蛋白质。在一个特别实施方案中，本专利技术提供一种一步合成PEG化胰岛素衍生物的方法，其中取代的位置主要是PheB1残基(B链的氮末端)。本领域所熟知的是，这种衍生物比天然胰岛素在物理性质上和酶学上更稳定。此外，衍生物比胰岛素更易溶于水/有机溶剂系统。此外，这些衍生物已经显示出较低的免疫源性，具有延长的循环半衰期。本专利技术的一个显著的优点是反应在接近中性的条件下进行，不需要的副反应(例如脱酰胺化，转酰胺化，氧化等)可以忽略。另一个优点是使用相对较小量的聚合物(例如PEG试剂)，这样节省成本。得到的蛋白质聚合物偶联物(例如PEG化胰岛素)可以单独使用，例如用于人类的治疗，或将其包封在缓释给药载体中，例如美国专利申请2002/0155158中所记载的。相应的，在一个实施方案中，本专利技术提供一种用于制备蛋白质-聚合物偶联物方法，其是通过在至少一种有机溶剂和至少一种金属鳌合剂存在下，在蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下，将胰岛素蛋白和亲水聚合物接触而进行的。然后可应用多种常规技术分离偶联物，例如柱色谱。在本专利技术的一种特别的情况中，亲水聚合物选自聚乙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化甘油、以及它们的线状、分支状和氨基反应性衍生物。适合的氨基反应性衍生物包括，例如，乙醛、PEG羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、PNP碳酸酯以及苯并三唑末端的亲水聚合物衍生物。典型的是，亲水聚合物和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备蛋白质－聚合物偶联物的方法，其包括：　（ａ）将胰岛素蛋白和亲水聚合物以约１．７∶１－１．２∶１的摩尔比例在至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下接触；以及　（ｂ）分离偶联物。

【技术特征摘要】
2003.4.11 US 60/4623641.一种一步制备位点特异性胰岛素蛋白-亲水聚合物偶联物的方法，其包括：(a)将胰岛素蛋白和亲水聚合物在5.0-7.5的pH下以1:1.7-1:1.2的摩尔比例在至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物通过所述胰岛素蛋白的在残基PheB1处的反应形成位点特异性偶联物且不在GlyA1和LysB29残基处保护所述胰岛素蛋白的条件下接触；以及(b)分离偶联物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述摩尔比例是1:1.7-1:1.5。3.一种一步制备位点特异性胰岛素蛋白-亲水聚合物偶联物的方法，其包括：(a)将胰岛素蛋白和亲水聚合物在5.0-7.5的pH下，在至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物通过所述胰岛素蛋白的在残基PheB1处的反应形成位点特异性偶联物且不在GlyA1和LysB29残基处保护所述胰岛素蛋白的条件下接触；以及(b)分离偶联物。4.一种一步制备位点特异性胰岛素蛋白-亲水聚合物偶联物的方法，其包括：(a)将胰岛素蛋白和亲水聚合物在5.0-7.5的pH下且在至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物通过所述胰岛素蛋白的在残基PheB1处的反应形成位点特异性偶联物且不在GlyA1和LysB29残基处保护所述胰岛素蛋白的条件下接触；(b)分离偶联物；以及(c)将所述偶联物包封在生物可降解的聚合物中。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述胰岛素蛋白包括人胰岛素。6.根据权利要求1-4中任一项所述方法，其中所述亲水聚合物选自聚乙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物和聚氧乙基化甘油。7.根据权利要求1所述方法，其中所述亲水聚合物选自聚乙二醇的线状的衍生物、聚乙二醇的分支状的衍生物、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物的线状的衍生物、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物的分支状的衍生物、聚氧乙基化甘油的线状的衍生物和聚氧乙基化甘油的分支状的衍生物。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲水聚合物选自聚乙二醇的氨基反应性的衍生物、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物的氨基反应性的衍生物和聚氧乙基化甘油的氨基反应性的衍生物，其中，所述氨基反应性衍生物选自醛、N-羟基琥珀酰亚胺、PNP-碳酸酯，以及苯并三唑封端的亲水聚合物。9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述胰岛素蛋白和亲水聚合物以0.1-5.0％的蛋白浓度相接触。10.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述金属螯合剂为多价金属离子螯合剂。11.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述金属螯合剂选自EDTA、去铁敏(DEF)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和双(氨基乙基)乙二醇醚N,N,N，,N，-四乙酸(EGTA)。12.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述金属螯合剂以0.1-10mM的浓度存在。13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述胰岛素蛋白和亲水聚合物在4-50℃温度下接触。14.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在分离偶联物之前中止偶联物形成的步骤。15.根据权利要求14所述的方法，其中通过降低pH至1-4来中止反应。16.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中使用色谱技术进行分离。17.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·海因兹，D·路易斯，P·施密德特，K·M·坎贝尔，
申请(专利权)人：PR药品有限公司，
类型：发明
国别省市：US