体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物制造技术

本发明专利技术公开了含有生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有２个至约５００个重复单元肽基序的多肽，所述生物活性蛋白质偶联物显示的血浆半衰期与未偶联生物活性多肽或蛋白质的固有半衰期相比有所改变。本发明专利技术也公开了制备和应用偶联蛋白的方法，以及确定某给定偶联物的半衰期相对于未偶联多肽的固有半衰期是否改变的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总地涉及生物活性蛋白质，更具体涉及改变生物活性蛋白质的半衰期。
技术介绍
作为人类治疗药物给予时，生物活性蛋白质的半衰期常常不理想。它们的固有 半衰期使得给药方案和剂量方案常常达不到最优治疗效果，产生顺从性问题和使患 者不方便。在用于人类治疗的生物活性蛋白质生产中，曾尝试通过物理方法(如改变给药途 径、纳米颗粒包装和脂质体包裹)、化学修饰(如乳化、PEG化和超糖基化)和遗传修 饰(如修饰蛋白质一级结构，聚合物标记、人血清白蛋白融合、惨入翻译后修饰)延长 生物活性蛋白质的半衰期。参见例如，Lord等，C7/w. Omceri^. 7: 2085-2090(2001) 和vanDerAuwera等，Hemafo/. 66: 245-251(2001)。然而，这些方法会产生其 它问题。通过物理方法延长生物活性蛋白质半衰期常常使药物复杂性增加，在制造 过程中增加了成本高和耗时的下游加工。化学修饰可能改变生物活性蛋白质的生物 学活性或安全性。通过重组DNA合成法制备生物活性蛋白质时，需要根据具体应用 在特定的细胞表达系统中评估遗传修饰对蛋白质产率和纯度的影响。因此，需要改变生物活性蛋白质的固有半衰期的其它方法。专利技术概述本专利技术一方面涉及包含生物活性多肽的蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过 肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽(氨基酸延伸物)。该基序包含 主要组件和次要组件，其中主要组件是选自Gly(G)、 Asn(N)或Gln(Q)的一种氨基酸 的两个或多个残基，次要组件是选自Ala(A)、 Ser(S)、 Thr(T)、 Asp(D)、 Gln(Q)、 Glu(E)、 His(H)或Asn(N)的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是没有一种氨基酸同 时存在于主要组件和次要组件中，与未偶联的生物活性多肽的固有半衰期相比，该 偶联物的血浆半衰期有所改变。本文所用术语"改变"指与未偶联的生物活性多肽或蛋 白质本身的血浆半衰期(即固有半衰期)相比半衰期延长或缩短。术语"固有半衰期"指 天然生物活性多肽的半衰期或未偶联形式(因此包括重组形式的天然多肽)多肽的半 衰期。在一些实施方式中，所述肽基序包含3-6个氨基酸残基(即3、 4、 5或6个)。在 一些实施方式中，所述肽基序含有5或6个氨基酸残基，次要组件包含所述肽的1 个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述肽基序的序列由N和T氨基酸残基、N和 E氨基酸残基、Q和S氨基酸残基或N和Q氨基酸残基组成。在一些实施方式中， 所述氨基酸延伸是在所述生物活性多肽的N-末端；在一些实施方式中，是在所述生 物活性多肽的C末端；在其它实施方式中，延伸位于所述生物活性多肽的N和C-末端。在一些实施方式中，所述生物活性多肽是细胞因子(如粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、人生长激素或干扰素、如|3-干扰素或Y-干扰素)、抗体、抗体片段、蛋白 水解抗体片段或结构域、单链抗体、遗传或化学优化的抗体或其片段、可溶性gpl20 或gpl60糖蛋白、凝血因子、可溶性受体如肿瘤坏死因子(TNF)-aII型受体、治疗酶 或红细胞生成素(EPO)。在一些实施方式中，所述蛋白质偶联物的半衰期经改变比未 偶联的生物活性多肽的固有半衰期縮短，例如所述生物活性多肽包括重组的活化蛋 白C或重组因子VII。本专利技术另一方面涉及含有蛋白质偶联物和载体的组合物。在一些实施方式中， 所述组合物是药物组合物，所述载体是药学上可接受的载体。本专利技术另一方面涉及编码上述蛋白质偶联物的嵌合DNA分子和含该嵌合DNA 分子的载体，以及用该嵌合DNA分子或含有该嵌合DNA分子的载体转化的细胞。 在一些实施方式中，所述载体是质粒，如pCE2。在一些实施方式中，所述细胞是哺 乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或者是细菌如大肠杆菌(五.co//)，或酵母。本专利技术另一方面涉及制备包含生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物的方法， 所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个含主要组件和次要组件的肽 单元的多肽，所述主要组件是选自Gly(G)、 Asn(N)或Gln(Q)的一种氨基酸的两个或 多个残基，次要组件是选自Ala(A)、 Ser(S)、 Thr(T)、 Asp(D)、 Gln(Q)、 Glu(E)、 His(H) 或Asn(N)的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是没有一种氨基酸同时存在 于所述主要组件和所述次要组件中，因而与未偶联的生物活性多肽的固有半衰期相 比，所述生物活性蛋白质的血浆半衰期有所改变，所述方法包括在表达编码所述蛋白质偶联物的嵌合DNA分子的条件下培养用所述DNA分子转化的细胞，从而产 生所述蛋白质偶联物；和从所述细胞中提取所述嵌合DNA分子的表达产物。本专利技术另一方面涉及测定某给定蛋白质偶联物的血桨半衰期相对于未偶联生物 活性多肽的固有半衰期发是否变的方法，所述方法包括a)制备包含生物活性多肽的 蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽 基序的多肽，所述基序包含主要组件和次要组件，其中主要组件包含选自Gly(G)、 Asn(N)或Gln(Q)的一种氨基酸的两个或多个残基或由其组成，次要组件包含选自 Ala(A)、 Ser(S)、 Thr(T)、 Asp(D)、 Gln(Q)、 Glu(E)、 His(H)或Asn(N)的一种氨基酸的 一个或多个残基或由其组成，没有一种氨基酸同时存在于所述主要组件和所述次要 组件中，和b)检测该蛋白质偶联物以确定该蛋白质偶联物的血浆半衰期相对于未偶 联生物活性多肽的固有半衰期是否改变。附图简要说明附图说明图1是PHOxpBSK载体的示意图。 -图2是PH0-G-CSF-NNxpBSK载体的示意图。 图3是PHO-G-CSF-(NNT)65 x pBSK载体的示意图。 图4是PHO-G-CSF-(NNT)155 x pBSK载体的示意图。 图5是PHO-G-CSF-(NNT)155 x pCE2载体的示意图。 图6是几种不同G-CSF-多肽偶联物和未偶联G-CSF的Western印迹。 图7是电泳前用PNG酶F处理的几种不同G-CSF-多肽偶联物和未偶联G-CSF 的Western印迹。图8是用PROCH04-CDM培养基培养的CHOK1细胞中表达的 G-CSF-(NNT)155和G-CSF-(NNT)65构建物(一式两份)的Western印迹。专利技术详述本文所用术语"多肽"指没有特定长度的氨基酸聚合物，除非另有说明。因此，" 多肽"的定义包括肽和蛋白质，在本说明书、以及权利要求书中，可互换使用这些术 语。术语"多肽"不排除翻译后修饰，如具有共价连接的糖基、乙酰基、磷酸基团、脂 质基团、脯氨酸或赖氨酸羟基化等的多肽。"多肽"的定义也包括其同源物。本文所用术语"纯化"指生物活性蛋白质偶联物已纯化的水平足以满足其应用所需。总的来说，本专利技术涉及包含生物活性多肽的蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有2个至约500个重复单元肽基序的多肽，所述基序包含主要组 件和次要组件，其中主要组件是选自Gly(G)、 Asn(N)或Gln(Q)的一种氨基酸的两个 或多个残基，次要组件是选自Ala(A)、 Ser(S)、 Th本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有生物活性多肽的生物活性蛋白质偶联物，所述生物活性多肽通过肽键偶联于含有２个至约５００个包含主要组件和次要组件的肽单元的多肽，其中主要组件是选自Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｓｎ（Ｎ）或Ｇｌｎ（Ｑ）的一种氨基酸的两个或多个残基，次要组件是选自Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｈｉｓ（Ｈ）或Ａｓｎ（Ｎ）的一种氨基酸的一个或多个残基，限制条件是：没有一种所述氨基酸同时存在于所述主要组件和所述次要组件中，因而与未偶联的生物活性多肽的固有半衰期相比，该生物活性蛋白质偶联物的血浆半衰期有所改变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M贝斯曼，S齐普曼，D里昂，J辛格，
申请(专利权)人：细胞治疗学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]