本发明专利技术涉及包括结晶的Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ的纯化。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用低温下结晶纯化APO-2配体/TRAIL的方法专利
本专利技术涉及结晶参与的Apo2L/TRAIL的纯化。 专利技术背景已经有多种分子鉴定为肺瘤坏死因子("TNF，)细胞因子家族的成员，诸 如肿瘤坏死因子-a("TNF-a")、肿瘤坏死因子-P("TNF-(3"或"淋巴毒素-a")、 淋巴毒素-(3 ("LT-卩")、CD30配体、CD27配体、CD40配体、OX-40配体、 4-1BB配体、Apo-l配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也 称作Apo2L或TRAIL) 、 Apo-3配体(也称作TWEAK) 、 APRIL、 OPG 配体(也称作RANK配体、ODF或TRANCE)和TALL-1 (也称作BlyS、 BAFF或THANK )。在这些 分子中，TNF-a、 TNF-(3、 CD30配体、4-1BB配体、Apo-l配体、Apo-2配 体(Apo2L/TRAIL)和Apo-3配体(TWEAK)有报道说涉及凋亡性细胞死亡。数年前将Apo2L/TRAIL鉴定为TNF细胞因子家族的成员。全长人Apo2L/TRAIL多肽是长281个氨基酸的II型跨膜蛋白质。有些细胞能通过酶促切割多肽的胞外区而生成该多肽的天然可溶形式。对可溶形式 Apo2L/TRAIL的晶体学研究揭示了与TNF及其它相关蛋白质的结构类似的 同三聚体结构。然而，与其它TNF家族成员不同，发现 Apo2L/TRAIL具有独特的结构特征，即三个半胱氨酸残基(同三聚体中各 个亚基的第230位) 一起与锌原子配位，而且锌结合对于三聚体的稳定性 和生物学活寸生来i兌是重要的。文献中已有报道，Apo2L/TRAIL可能在免疫系统的调节中起作用，包 括自身免疫病，诸如类风湿性关节炎和HIV治疗中。还有报道，在体外可溶形式的Apo2L/TRAIL在多种癌细胞中诱导凋亡， 包括结肠、肺、乳房、前列腺、膀胱、肾、卵巢和脑肿瘤，以及黑素瘤、 白血病和多发性骨髓瘤。在鼠肿瘤模型中进行的体内研究进一步表明，单独使 用的或者联合化疗或放疗的Apo2L/TRAIL能发挥实质性的抗肿瘤作用。与许多类型的癌细胞相反，大多数正常人细 胞类型表现出对某些重组形式Apo2L/TRAIL的凋亡诱导有抗性。Jo等人报道，附加多组氨酸标签的可溶 形式Apo2L/TRAIL在体外在正常的分离的人肝细胞中诱导凋亡，在非人源 的肝细胞中则不然。有人认为，某些重组Apo2L/TRAIL制备物在生物 化学特性和生物学活性方面对患病细胞和正常细胞可有所不同，这取决于 例如标签分子的存在与否、锌含量和三聚体含量百分比。细胞受体的结合所引发的。先前，鉴定了约55 kDa (TNFR1)和75 kDa (TNFR2 )的两种不同TNF受体。发现这些TNFR共有细胞表面受 体的典型结构，包括胞外区、跨膜区和胞内区。发现两种受体的胞外部分 在天然条件下也作为可溶的TNF结合性蛋白存在。1型和2型TNFR ( TNFR1和TNFR2 )的胞外部分含有4个富半胱氨 酸结构域(CRD)的重复氨基酸序列模式，从NH2末端起以1到4指称。 。类似的CRD 重复模式存在于数种其它的细胞表面蛋白中，包括p75神经生长因子(NGFR) 、 T细胞抗原 OX40 和Fas抗原。 CRD还在Shope和粘液瘤痘病毒的 可溶性TNFR(sTNFR)样T2蛋白质中有发现。这些序列的最优比对结果暗示半胱氨酸残 基的位置非常保守。有时将这些受体统称为TNF/NGF受体超家族成员。除了淋巴毒素-(3以外，迄今为止鉴定的TNF家族配体都是典型II型跨 膜蛋白质，其C-末端在细胞外。与之相反，迄今为止鉴定的TNF受体(TNFR) 家族的大多数受体是典型的I型跨膜蛋白质。然而，在TNF配体和受体两 个家族中，发现在家族成员间鉴定的同源性主要位于胞外域("ECD")。数种 TNF家族细胞因子，包括TNF-a、 Apo-l配体和CD40配体，在细胞表面受 到蛋白水解切割；在每种情况中所得蛋白质通常形成同三聚体分子，其发 挥可溶性细胞因子的功能。TNF受体家族蛋白质常常还受到蛋白水解切割 而释放可溶性受体ECD，其能发挥相关细胞因子抑制剂的功能。Pan等人披露了称为"DR4"的另外的TNF受体家族成员。 DR4有报道说包含能够与细胞自杀机制联动 的胞质死亡域。据Pan等人披露，有人认为DR4是称为"Apo-2配体"或 "TRAIL"的配体的受体。在Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)和Pan et al.， Science, 277:815-818 (1997)中记载了另 一种据说是Apo2L/TRAIL的受体的分子(还 可参见WO 98/51793,公开于1998年11月19日；WO 98/41629，公开于1998 年9月24日)。该分子称为DR5或称作Apo-2、 TRAIL-R、 TR6、 Tango-63、 hAP08、 TRICK2或KILLER) ( Screaton et al.， Curr. Biol" 7:693-696 (1997); Walczak et al" EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al" Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO 98/35986,公开于1998年8月20日；EP 870,827,公 开于1998年10月14日；WO 98/46643,公开于1998年10月22日；WO 99/02653,公开于1999年1月21日；WO 99/09165,公开于1999年2月25 日；WO 99/11791，公开于1999年3月11日)。像DR4—样，DR5有报道 说包含胞质死亡域且能够发出凋亡信号。Apo-2L/TRAIL和DR5间形成的 复合物的晶体结构记载于Hymowitz et al" Molecular Cell, 4:563-571 (1999)。最近鉴定的另 一类TNFR家族成员称为"诱饵受体"(decoy receptor),它 们被认为发挥信号传导抑制物而非转换器的功能。该组包括DCR1 (也称作 TRID、 LIT或TRAIL-R3 ) 和DCR2 (也称作TRUNDD或TRAIL-R4 ),这两种细 胞表面分子，以及OPG 和DCR3 ，它们都是分泌型可溶性蛋白质。Apo2L/TRAIL有报道 说结合那些称为DcRl 、 DcR2和OPG的受体。Apo2L/TRAIL被认为经由细胞表面"死亡受体"DR4和DR5起作用而活 化胱天蛋白酶或执行胞内细胞死亡程序的酶(参见例如Salvesen et al.， Cell, 91:443—446 (1997))。配体结合后，DR4和DR5都能经由称作FADD/Mortl 的含死亡域的连接物(adaptor)分子通过募集和活化凋亡起始物胱天蛋白酶 -8而独立触发凋亡。与DR4和DR5相反，DcRl和DcR2受体不转导凋亡信号。关于TNF细胞因子家族及其受体的综述参见Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从混合物回收Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ的方法，包括 （ａ）将混合物加载到阳离子交换柱上； （ｂ）用平衡缓冲液冲洗阳离子交换柱，从而去除混合物中存在的非结合性组分； （ｃ）用洗脱缓冲液洗脱结合在阳离子交换柱上的Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ； （ｄ）将洗脱物逐渐冷却到大约２～４℃的温度，从而使Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ以晶体形式自发沉淀，产生母液和Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ晶体的混合物，和 （ｅ）从步骤（ｄ）中所得混合物中回收纯度为至少大约９９％的Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：希瑟弗洛里斯，塔尼娅P林，蒂莫西C马修斯，罗杰佩，扎拉沙罗克，
申请(专利权)人：健泰科生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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