【技术实现步骤摘要】
本专利技术一种在原核生物里表达异源PNA顺序(例如真核生物基因)的方法。在其中一个重要的实施例中，本专利技术指出了在原核生物里生产具有一个N端为丙氨酸多肽以及用本方法能够生产各种N端为丙氨酰的多肽。也包括能增加牛奶产量大到出人意料程度的一类缬氨酸bGH(牛生长激素)品种。由真核生物和原核生物表达基因，在基因转录至信使RNA(mRNA)以及随之又把这种mRNA转译成蛋白质中都具有相同的基本步骤时，则要应用细胞内的不同组合以控制这些步骤。此外，在真核生物里，许多成熟的蛋白质首先被转译成为前一蛋白质;即含有与引导顺序或信号顺序融合的成熟蛋白质顺序的多肽。真核生物的信使RNA(mRNA)编码整套前一蛋白质，它们在转译后被加工除去引导顺序以后才成为这种成熟蛋白质的。真核生物细胞装备有把这样前一蛋白质转变为成熟蛋白质的特异加工机制，原核生物的细胞一般不能识别存在于真核生物的蛋白质里的这种加工处理信号。因此，如果真核生物信使RNA(mRNA)的完整互补DNA(cDNA)转录物被用作DNA顺序在原核生物里来表达，那就只发现前一蛋白质而无成熟蛋白质。前一蛋白质在体外转变为成熟蛋白质是有可能的，但不能没有重要的代价。在编码成熟蛋白质的DNA顺序在原核生物里用作成熟蛋白质表达的过程中，这一顺序将是没有真核的转译作用和通常包含在作引导顺序DNA里的转译后加工信号。因此，基于效能以及由于原核生物的宿主细胞也许不能识别真核生物的信号，现已证实，要在原核生物系统里表达所克隆的真核基团或其它异源DNA顺序。最理想的是应用原核生物控制讯号。“异源DNA”一词在此定义为核DNA至少其有一部分序...
【技术保护点】
本专利技术其特征是：至少包含有一个在１２６位或其附近含有缬氨酸的ｂＧＨ品种成分，其中所说品种的浓度，根据所有ｂＧＨ在所说成分中的重量，实质上是比在垂体收集的ｂＧＨ中同样含有缬氨酸品种的浓度要大。
【技术特征摘要】
US 1985-2-22 704,362;US 1986-2-4 824,202的目的看，则此原核生物可被列入“选中”。在本发明较佳的实施例中，大肠杆菌K12株的三种不同分离株，全都存放在美国马里兰州(Maryland)洛克维兰(Rsckville)标准菌种保存库并已标有ATcc 39936，53010，及53009的登记号。并注明上述N端的蛋氨酸后紧接丙氨酸时有除去N端蛋氨酸的能力。本发明由于它提供在原核生物里生产具有N端丙氨酸的异源多肽的方法而有价值。在其中一个较佳的具体实施例中，本发明的方法是用来生产两种bGH品种，bGH(A、L)及bGH(A、V)以及一种pGH品种pGH(A)它们分别不带有牛的或猪的蛋白质以及/或其他bGH或pGH品种。准确的说，本方法可为生产bGH(A、L)，bGH(A、V)或pGH(A)，作单一产种作准备。生产单一而氨基酸顺序与天然存在的生长激素相同的bGH品种或pGH品种的能力对测定每个bGH和PGH的已知品种的精确生物反应性是相当重要，bGH和pGH的很多潜在作用，大体上如前所引。事实上，已发现服用两种N-丙氨酰bGH品种中任一种都会产生例如象增加牛奶产量一样的这样bGH功能的可能性。此外。已发现的是给奶牛喂食按本发明生产的bGH(A、V)增加泌乳的剂量它的产奶量比用相似方法生产的bGH(A、L)在统计上有更大的增加(P＜0.05)。至今，在泌乳的哺乳动物里，还无教知有增加牛奶产量比较有效的特异bGH类型(品种)。而且在体内或体外还无先有成果可资说明在bGH品种间将能观察到在生物活性上的差异。因此，在牛奶产量上比亮氨酸等位bGH品种增加大的缬氨酸等位bGH品种的发现是既惊人又出乎意料。这个发现进一步说明bGH品种相对有效性的差异在增强其他生长激素特性如增高饲料效益和生长刺激也能同样地被确定。因此应用本发明的方法可以在细菌里生产至少二种垂体bGH分子型基本上是纯型，和/或用其它有用的技术，现在也能生产在达到特异生长激素诱导反应上最有效的bGH品种。这样有用的其它技术，包括，但不限于这些，化学合成整个bGH蛋白或它的片段，和/或用已知的重组DNA技术在其他微生物如酵母或在哺乳类细胞中进行生产。此外，一旦测定了每种天然存在品种的生物学活性，就得考虑能否生产每个这样品种的多肽变异型，它会进一步增加它们的生长激素的活性。因此，人们期望用核苷酸或用氨基酸删减取代以及/或加入来生产生长激素变异型将会提供在此公开bGH组成的各种有用的等值物。这类变异型包括一种bGH的交换型，其中交换过程包括把一个蛋氨酸加到氨基端去。用遗传上转化过的细菌所生产的这种变异型，亦已发现当按增加泌乳剂量服用时，奶牛产奶量增至惊人的程度。而且按照服用这个bGH(V)变种在泌乳上所观察到的增加程度发现比依照服用其他在126位氨基酸上为亮氨酸的相同变种所观察到的泌乳可测得的增加程度更大。但申请者不希望拘束于下列理论的机制，该理论机制表明在126位亮氨酸被缬氨酸代替，可大大增加这些生长激素蛋白的生物有效性或生物反应性。明确地说，生长激素蛋白用X-线完成的晶体学表明，所说蛋白上大约90个氨基酸到135个氨基酸组成了相对的柔性区，其它蛋白的研究已说明柔性区常已含有生物活性位点(即与生物受体相互作用的位点或/和同一蛋白的其他部位以达到生物活性型)。因此，可以予见的是，bGH(A，V)的另外变株，它包括在上述柔性区内氨基酸代替、删减、增加和/或倒位的变株，和/或在这个区域之外，但在泌乳增加(即牛奶生产)测度上有相同结果而比其他同样的亮氨酸bGH品种或bGH(A，L)要大的变株，都能够被制作。例如改变126位或126位左右的氨基酸，包括用更亲水的和/或更小的氨基酸(指与亮氨酸相比)去代替以提供在牛奶产量上所说的增加到不能忍受程度前不减小。进一步可以予见的是含N端phe，或N端ala-1的缬氨酸bGH品种，当给奶牛服用时能够达到上述增加牛奶产量。也可以予见的是，变化其氨基末端(即mef-1)，它实质上与天然存在bGH的N端相同将不会干扰缬氨酸bGH品种增加牛奶产量比其他相同亮氨酸bGH品种或bGH(A，L)增加程度大到不能忍受程度的能力。还进一步可以预见到，其中缬氨酸bGH品种浓度，依据所有bGH在组成上的重量计实质上比在垂体bGH制品中所收集的缬氨酸bGH品种浓度大，因而将会达到上述增产牛奶的结果。在其广泛实施例中的一个实施例中，本发明细致地应用DNA重组体技术直接在原核生物里生产异源多肽。因此，发明的叙述是以所应用的重组DNA工艺学的技术基础知识为先需条件，它包括编码多肽的DNA顺序的分离与克隆DNA顺序的重排与交换，克隆了的或经修饰过的DNA顺序在转化过微生物中的表达。这样的技术已处于工艺技术范畴之内。(见，例如，分子克隆化实验手册MolecularCloningAlaboratory Manual;Maniatis，Fvitrhd Sanbrooh ods，1982)异源DNA的分离以及/或构建在本发明的一个实施例里，已被选得或分离到为在原核生物里待生产想要得到的编码异源多肽的DNA顺序，或是说，编码它的DNA顺序已构建或已被化学合成。在许多重要的实施例中，这种多肽是一种真核生物蛋白质。如果这种多肽不大而且已知它的完整氨基酸顺序，一个合成的DNA分子或编码多肽的顺序就能够被构建。如果这种多肽的氨基酸顺序不知道，或是它或过大而实际上不能合成相应的DNA顺序，则可从表达这种多肽组织或细胞里获得的相应信使RNA，用它的逆转录能制备一个互补DNA(cDNA)顺序。例如，在本发明的一个实施里，bGH的顺序能够用Goodman等人，在酶学方法(Methods in Eniymolog)6875-90(1979)所述的目前常用的步骤从牛的重体获得。另一方面，一个互补的DNA(cDNA)顺序能够用以一适当的探针从生产GH动物基因库中分离得到的染色体组DNA转化细胞再从中分离出信使RNA(mRNA)中制备。染色组DNA亦可在不同的运载体系统进行修饰，使能在原核生物里表达。这些技术皆属工艺技术范畴。一旦获得想要的多肽密码子的异源DNA顺序、有可能在该分子的核酸顺序上作一那修饰。例如，如果这一分子已从mRNA模板逆转录产生，它往往含有至少一部分是编码前-蛋白质的引导顺序的DNA。因此，必须除去想得到的蛋白质第一个密码子前面的所有带引导顺序的DNA。在某些情况下，如果这一顺序还未具有-N-端的丙氨酸密码子就有必要在编码想要得的蛋白质顺序引起点加进或替代一个丙氨酸密码子。随后在上游引入一转译起动信号(它亦是一蛋氨酸密码子)而且直接紧靠着丙氨酸密码子。虽然这个启始信号/蛋氨酸密码子通常会(而且较常地)是核苷酸顺序ATG，但GTG顺序偶然也能用作启动信号/蛋氨酸密码子。此外在本发明的方法内，把出现多于一个蛋氨酸密码子，即2，3或可能更多的邻接蛋氨酸密码子都理解为组建功能等值。如果还未出现，也至少有一转译停止信号必须引到为羧基端氨基酸而编的密码子之后。转译停止信号的例子包括脱氧核苷酸三联体TAA，TGA，及TAG。因此，从本质上看，重组体DNA技术是用来组建重组体DNA顺序的，这些顺序按序地包括一个转译启动信号/蛋氨酸密码子，具有紧靠启始信号N-端丙氨酸密码子期望得到的多肽的密码子以及至少一个靠着为C-端氨基酸密码子的转译停止信号。已发现在mRNA内由氢键结合将两个互补的核苷酸系列形成二级结构能够阻碍信使RNA的有效表达。消除这些互补的顺序，特别是编码N-端的分子的那段顺序，有利于将核糖体结合到mRNA上，从而增加表达级别。因此，有可能用氨基酸相同的密码子但包含不同的核苷酸三联体去取代那些参与形成二级结构的密码子。参阅全欧专利75，444(1983，3，30出版);Seebury等人，(1983)DNA 237-45和shoner等人(1984)。proc，Nat′l Acad.Sci.U.S.A.81.5403-5407。组建异源DNA顺序的其他方法对熟悉本行技术者们是很清楚的。例如，如果DNA分子合用的话，它编码的多肽是以NH2-met-X-y的N-端结构表达的，式中的X是除丙氨酸外的任一种氨基酸，一个丙氨酸密码子之间。另一方面，X密码子可以删去，而用丙氨酸密码子代而插在其中。因此，在本发明的工艺过程里，将会产生N-端分别具有NH2-ala-X-y或NH2-ala-y……的蛋白质。同样的，也许会对一个已知基因顺序的任一氨基酸密码子进行删减，加入以及/或取代，所以在本发明的工艺过程里就会表达出变异的多肽。一个“变异的”多肽在这里定义为与已知多肽天然存在的氨基酸顺序相比，有独个或多个氨基酸被删去，取代或加进。这样的变异实例包括在，但不局限在met-bGH(L)及met-bGH(D)型，这些变异品种的bGH的氨基酸顺序除了在N-端出现一个额外的蛋氨酸之外分别与bGH(L)和bGH(V)相同，都是用牛的垂体体细胞生产的。被构建成的这些变异的多肽的氨基酸顺序具有与天然存在的多肽基本相似。只要其生物活性不会减到不允许的程度。为达到增加积留，提高蛋白质的稳定性，便于纯化多肽以及/或使生物活性达到最适的程度，创建与表达变异多肽是有希望的。上述编码期望得到的多肽的DNA分子的修饰能够使用限制性酶类，外切核酸酶，内切核酸酶等等的已知技术来完成。寡聚核苷酸一导致位点特异诱变的一般技术亦能在DNA分子的结构或顺序上起到上述修饰的作用。而这些一般性技术是熟知本行技术的人所知道的。参阅例如，Eoller及Sncith(1982)Nuo.Acids Res.106487-6500;Ealler及Smith，(1983)Meth.Enrymol.100418500;Norris等人，(1983)Nuc.Acids Res，115103-5112。按照重组体DNA技术，一旦获得想要得到的异源DNA顺序之后，就要将该顺序插入到一个合适的能提供复制这一DNA顺序的克隆运载体里。任何合适的克隆运载体都可采用，但最好是采用那些含有标记功能的克隆运载体，它包括colEL，Hershfield等人，Proc Nat′l，Acad，Scio V.S.A(1974)713455;pBR322，Boliuer等人，Gene(1977)295，pBR325，Soberon等人;Gene(1978)4121;以及pKcT，Rao等人，Gene(1979)779;以及大肠杆菌E，cali噬菌体运载体，它包括Charon入L47.1，Loenen等人，Gene(1980)10249;以及M13mp8和M13mp9，Messing等人，Gene(1982)19269。把上述DNA顺序插到一克隆运载体里去生成一个重组体的运载体的一般技术是属于工艺技术范围。参阅，Malecular CloningA Laboralory Munual;Maniatis，Firtsch和Sam brooh，eds，(1982)。一旦获得期望得到的异源体DNA顺序的多重拷贝，这些顺序就可按后面较详细的说明那样从重组的运载体里移去这顺序，并把它插入到为生产和分离期望得到的异源蛋白的表达系统里。在将这些DNA顺序插入到一个表达运载体之前或之后可以用工艺熟练者所知的方法对异源体DNA顺序进行修饰。在本发明的一些例子里，Mesring等人在Gene(1982)19269所说的，修饰成含有一个Xbaz位点的M13mp8如图2所示，与M13mR9一道被选为克隆运载体，参考文献同上一。M13mp8及M13mp9集合为“M13mp运载体”其双链(ds)或复制型(RF)及单链(ss)DNA型都可作分离用的重组体运载体。RFDNA重组体运载体的分离，如图5，6及10所示便于随后把已复制了的希望得到的DNA顺序插到表达运载体上。另一方面，分离这些单链型重组体运载体，对在合适的5′到3′表达位置上含有的所期望得到DNA顺序的重组体运载体的分离，以及如图3、4和8所示对用寡聚核苷酸导致特异位点诱变一类的技术所修饰的任何DNA顺序的创建都是方便的。此外，M13运载体能按纳长度是以克隆一个典型而又完整的真核基因顺序高达四千对碱基(4Kb)的DNA片段或基因。用于M13运载体里的功能标记，正如Messing等人在Gene(1982)19269所述，它涉及与β-半乳糖苷酶有关的酶。确切地说，期望得到的异源DNA顺序被插到至M13运载体里的LacⅠ基因片段上。这样它就破坏了在M13运载体上lncE基因片段与寄主(即大肠杆菌JM101)细胞染色体上部分lncE基因片段间的正常互补作用，所以，所论的宿主不能再代谢在细菌培养基里存在的乳糖。用无任何外来基因顺序插入并承受有lacz基因片段的M13运载体去侵染的大肠杆菌E，coli，如果菌是在含有0.8%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取液，0.5%(W/V)氯化钠以及一种β-半乳糖苷酶指示剂配成的1XYT培养基里生长，是能够代谢存在于细菌培养基里的乳糖并产生出特微性的兰色的噬菌斑。用在M13lacI基因片段上已插入有异源DNA顺序的重组体运载体感染的大肠杆菌E.coli，如果仍是在上述培养基生长时，其噬菌斑的颜色就是透明的或无色的。据此，异源体DNA顺序插到这些克隆运载体的阳性反应可根据重组体运载体感染大肠杆菌寄主细胞后形成的无色噬菌斑进行鉴定。把编码bGH(L)及pGH(P)的DNA顺序插入到M13载体分别如图2和9所示。在一个较准的实施例中，象在seeburg等人，DNA(1983)2(1)37-45所作一样分别在细菌质粒pBGHex-1及pPGHex-1上的bGH(L)及pGH(P)DNA编码顺序是通过位点专一的限制性内切核酸酶切割方法从这些质粒分离得到的。应该注意的是，用细菌质粒pBGHex-1或pPGHex-1，分别对细菌转化，随后又分别在容许表达bGH(L)和PGH(P)密码顺序条件下进行培养可分别产生带有N-端蛋氨酸(即met-bGH(L)或met-pGH(P))的促生长激素。然后分别地把各个顺序插入到如图2和7所学的经修饰了的M13mp8运载体(M13mp8/Xbal)和M13mp9载体的复制型DNA(RFDNA)上。把期望得到的bGH(L)及pGH(P)DNA顺序插入到M13mp8/XbaL及M13mp9RFDNA是通过位点-专一的限制性内切核酸酶切割进行确定，仍分别如图2和7所示。随后，如Mcssing等人所述那样，见酶学方法(Methods in Enzymology 1983)10120用这些重组运载体中的一些运载体去感染大肠杆菌Jmlol Messing等人，在Gene(1982)19269上所说那样分离重组体运载体的单链DNA(SSDNA)Messing等人所引这些文献的有关部分在此併作参考文献。一旦分离到这种重组体运载体的单链DNA(SSDNA)可通过寡聚核苷酸导致专一位点诱发进行修饰而创建bGH(A、V)，bGH(A、L)、bGH(V)及PGH(A)的DNA编码顺序。确切地说，DGH(L)是用加一个丙氨酸密码子进行修饰，例如，在bGH(L)编码顺序的5′-末端上加GCC(如图3所示。可以予见的是编码丙氨酸4个密码子中的任何一个都可以加入为得促生长激素最好产量而最好的编码丙氨酸密码子在这里表达系统中应用的是GCC。加入一个丙氨酸密码子而创建的bGH(A、L)编码顺序可借用Sanger等人1)Proc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.(1977)745463的方法对整个bGH(A、L)的DNA顺序或其5′-末端的DNA顺序分析而进行确证。bGH(A、V)编码顺序是通过bGH(A、L)密码顺序的寡聚核苷酸导致特异位点诱发而生成的如图4所示、或是用127位氨基酸〔在bGH(A、L)是如此〕即亮氨酸、密码子变为缬氨酸密码子，例如转变成GTG。再一次可以肯定的是，任何缬氨酸密码子都可用于这类转变。这类bGH(A、V)密码顺序的创建仍然是通过对终产物bGH(A、V)编码顺序的DNA序列分析进行确认。能使感染有包括bGH(V)编码序列的表达载体的细菌中产生met-bGH(V)蛋白的编码顺序也同样可用寡聚核苷酸导致特异位点突变而创建，使bGH(L)编码序列在126位(在bGHL上)氨基酸改变成缬氨酸密码子GTG。这种通过PGHCP)编码顺序的寡聚核苷酸导致特异位点诱发而创造PGH(A)编码顺序同样地象图8所示过程那样以及象后面将要较详细说明那样进行完成的，而且仍是通过DNA顺序分析进行确认的。如果现在已分离和组建的这种期望得到的异源DNA顺序象所列举的bGH(A、L)bGH(A、V)及bGH(A)则，这些顺序可以靠熟悉本行技艺者们用已知的方法和参照上述文献扩增各个重组体运载体以复制和产生很多的拷贝数。现在这些异源DNA顺序就可以被插入到任何适合表达运载体上使在原核生物里生产这类期望得到的异源多肽。N-端丙氨酸多肽的生产象前面讨论的那样在选定的宿主细胞里，一个适合表达的运载体应该含有为生产异源蛋白必需的转录与转译信号和与之一起用以识别那些已插入有异源DNA顺序的表达运载体上的功能标记。用原核生物的表达载体，能够通过转导作用，转化作用，或者转染作用(在此通称“作转染作用”)把重组体DNA顺序引入与其基因互补的生物体中，然后所说的原核生物能够在一定的条件里培养C一般都由启动子和所用宿主控制)从而导至生产出期望得到的异源蛋白质。因此，在本发明里所用的“染色体组”DNA包含有染色体的和附加体的DNA。为了表达异源基因及在源核生物的宿主细胞里生产异源蛋白质。许多表达运载体已被描述，而且都为熟悉本行技艺者们掌握。在本发明一个较佳的实施例里，应用了表达运载体pBGHex-1参阅Seeburg等人”DNA(1983)2(1)37-45.以及pBGHex-1＊，还包括已修饰过的pBGHex-1运载体。表达运载体bGHex-1是一种带有bGH(L)基因的细菌值粒pBR322。这个基因依次包括一色氨酸启动子(ptrp)。一Shine-Delgarro顺序，一种除接在N-端苯丙氨酸编码顺序上的ATG转译启动/蛋氨酸密码子，bGH(L)多肽的第一个氨基酸，bGH(L)编码顺序以及一个转译停止密码子。有关pBGHex-1表达载体的功能标记是抗菌素抗性。确切地说，pBGHex-1带有两种抗菌素抗性基因，一种是抗氨苄青霉素抗性(ampr)而第二种是抗四环素抗性(tetr)，这两种抗性由于表达运载体授与其它敏感性宿主细胞以对抗菌素的特异抗性而稳定地被转化。因此稳定的转化体通入在含有四环素，氨苄青霉素或二者都有的培养基上生长可以被选出来。在本发明的一些例子里，表达运载体PMON3209以及包括有分别带bGH(A、L)及bGH(A、V)编码顺序以代替bGH(L)编码顺序的pBGHex-1质粒在内的pMON3215都分别如图5和6所示那样过程产生的。象大肠杆菌样的细菌随后被这些表达运载体的一种所稳定地转化，而且转化体通过在含有适当抗菌素的培养基上生长而被选出，在转化的细菌里含有的这些表达运载体随后用限制性酶切割方法查对在正确的5′至3′位置上筛选bGH(A，L)及bGH(A，V)编码顺序的存在。在本发明的一个例子里pBGHex-1＊包括位于ptrp编码顺序5′端上游经除去EcoRI酶切位点方法修饰过的pBGHex-1也被应用以创造带有pGH(A)编码顺序代替bGH(L)编码顺序的表达运载体PMOM3213终产物pBGHex-1运载体只含有单一的EcoR1位点如图9所示在pBGHex-1＊里用PGH(A)编码顺序代替bGH(L)编码顺序以创造表达运载体pMON3213图10所示。然后用所说混合物转化大肠杆菌，同时通过在含有抗菌素的培养基上生长选取转化体。在经过转化的细菌里含有的表达质粒随后用限制切割筛选pGH(A)编码顺序的存在。在大肠杆菌里生产bGH(A、L)，bGH(A、V)或bGH(A)是用表达运载体pMON3209，pMON3215或pMON3213中任一种按照后面较详细说明的方法通过转化大肠杆菌株多E Codi W3110LE392或294而实现的，这些株多的ATCC登记号分别为39936，53010，及53009。转化了的大肠杆菌(E，COLi)W3110随后在容许表达生长激素基因和生产这种期望得到的异源多肽的条件下进行培养。所产异源肽的纯化将随蛋白质及所选的宿主细胞二者而定。例如，曾观察到在象大肠杆菌那样的细菌里生产的异源蛋白质常常以“折射体”的形式在细胞里沉积，采用“折射体”一词是因为这些物体实际上用相差显微镜能够看见的。一种回收异源蛋白质及回收在生物学上有活性物质有用的方法已在全欧专利申请114，506(1984.8.1出版)里叙述，在此併作参考文献。这个纯化的方法简言之包括浓缩宿主细胞，将它们裂解以产生细胞提取液或匀浆液，继而用差速离心分离这些折射体，其中所有步骤对熟知本行技艺者都是知道的。分离得的折射体溶于一种象盐酸胍一类的强变性剂里，这种溶解了的蛋白质随后在适当的溶剂里(例如尿素)交换，用层析法纯化。最后使之在生物学上活化。即容许它呈假定的活性构型然后进行氧化之。因而使这样的构型就象在全欧专利申请114，506所述那样，通过它合适的半胱氨酸残基间的二硫键而保持它的构型。这种异源蛋白质更详细的纯化过程在两个同时申请的美国专利里叙述，其一是由storrs s.B题名生长激素可溶解化的方法“Method of somatotropin Solobibilitation”，而另一由Bentle，L.A storrs.S.B及Mitchell J.W.题名生长激素自然化的方法“Method of Sometotropin Natura-tion”，在此均併作文献。”这两个同时申请的美国专利以及本申请一起全都同意转让给mon Santo公司。从这种异源多肽上去除污染的细菌性蛋白质的进一步纯化，可通过象凝胶过滤处理或离子交换层析的常规层析方法能够达到。经这样处理纯化过的组成物，典型地将含有N-丙氨酸、多肽大约为其全重的90%至99.5%而由细菌产生的蛋白质或在其它原核生物宿主上产生的多肽。大约为0.5%到10%。已发现用本发明的方法所表达的异源肽，通常至少有大约80%具有-NH2-a/a的N端结构……其余的多肽有代表性的是呈蛋氨酰型式，它具有-NH2-met-a/a……的N端结构。然而，以不同的培养条件以及/或者诱导基因表达的时间，就有可能提高N端具有丙氨酸的多肽的比值至少到95%或甚至更高一些。在本发明的一个特别好的实施例中，根据前面叙述那样生产和分离的多种生长激素多肽按照Tsushina及Frieses在J.clin，Endocpinol.Metab.(1973)37334-337所说那样在家兔肝受体上分析完成的方法进行测定以及对小白鼠增重的生物分析都表明有类生长激素的生物活性。在后者的分析里，大肠杆菌产生的生长激素的生物活性是通过切除重体小白鼠分别主入不同剂量待测生长激素与注入一些已知的生长激素(例如猪或牛的垂体生长激素)后所得小白鼠的相对增重进行评定。确切地说，给去除垂体的小白鼠(体重95-135克)注射滴定剂量未知的或标准的(0至60微克之间)生长激素，按日为基础进行7天或更长的试验时间。使用多重回归分析，接受已知或未知激素组的动物的体重增量与剂量的对数变换值呈回归，测试斜率以确定非平行现象及截距普遍性。生物活性是以斜率的比值乘标准的活性。使用本发明的带有N-丙氨酸的bGH产品增加了奶牛的产奶量，而且认为该奶牛获得特定出奶量所需饲料量下降。对奶牛按增强泌乳量施用，在成熟蛋白质大约126位或相近处有一缬氨酸的bGH品种是特别适于促进这些奶牛产奶的。本发明的这类产品可以用注射，灌输或移植在多聚物或其它众所周知在循环系统里达到输送必要剂量的基质给奶牛施用，也许可以用象溶剂、乳剂或凝胶那样的药物上可接受的基本配制方法，也可用胶囊或不用胶囊，这些配方可单独含有bGH品种或其变型，或前面说过的一些天然存在的复合型以及/或者变异多肽〔例如，一种bGH(A、V)和bGH(A、L)的混合物以及/或者bGH(A、V)和蛋氨酸-bGH(A)的混合物〕。每畜每天的剂量从少至大约0.005mg直至大约200mg，而每畜每天最佳剂量从大约5mg至大约40mg。增加产奶量和/或增加饲料牛奶效应最有效的剂量可以通过常规的试验来测定。bGH实际的最佳剂量是由特定动物的大小，一般健康以及营养状况的差异而决定的。在奶牛上，产奶虽然能用来分析bGH的作用，但牛的其它生产性能，象总生长率及产肉情况亦能用来分析。如果希望的话，bGH能和其它有益的制剂，象其它的生物活性蛋白质，抗原或类似物及由此而获得增效的制剂一起施用。正如前面讨论过一样，本发明亦期望bGH变异型的产品其上有-N-端丙氨酸，但此沿着多肽链可进行删减、加进倒转和/或取代。这种具有期望得到的泌乳和/或生长增效功能的修饰作用能够通过在牛里进行的常规试验鉴定。下列例子阐述了较佳的实施例本发明，但无论如何不想限制本发明的界限。虽然本发明已在与发明有关的较好的实施例中作了阐述熟知本行技术者从阅读这个申请里，提出各种各样的修正那将是显然的。微生物及质粒下列微生物可从美国标准菌种库(ATTC)1230 1 parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852，U.S.A.获得ATCC 39936 - E. Coli W3110ATTC 53010 - E. Coli LE392ATTC 53009 - E. Coli Strain 294ATTC 53024 - E. Coli W3110(pMON3209)ATTC 53022 - E. Coli W3110(pMON3215)ATTC 53023 - E. Coli W3110(pMON3213)这些存放菌种可通过本申请的受让人(Monsanto公司)取得美国专利(局)同意而为共众使用。这些存放菌种将会由于这个申请具有申请日期开始获利的任何这样的美国(U.S)专利的有效期内而可取得使用。然而，必须明了这些存放菌种的可用性并不构成允许去实施本主题的发明以贬低政府同意颁发的专利权。况且本发明不限于存放微生物的范畴，因为这个存放菌种的实施例只是企图作为本发明的具体阐述而已。例一所有的寡聚核苷酸的合成都是依据制造厂应用生物系统公司(Applied Biosystem，Inc.Foster City，Califor-nia)提出的步骤用一个应用生物系统DNA合成仪在Monsanto公司生物科学部(Department of Biological Science，Monsanto)进行的、限制性内切酶和DNA修饰酶是由新英伦生物实验室(New England Biolabs Beverly，MassaChu-setts)新英伦核子公司(New England Nuclear，Boston，MassachuSetts)及Bettesda研究实验室(Bethesda Research Laboratories，(BRL)(Gaithersburg，Mary-land)供应。限制性核酶内切酶Xbal接头(XbaI linker)是从合作研究公司(Collaborative Research，InC.(Lexing-ton，Massachus etts)获得、T4DNA连接酶是由BRL供应。T4DNA激酶是从新英伦生物实验室购买。32p-林记核苷酸是由Amercham(Arlington Heights，Illinois)供应。E.Coli DNA多聚酶I.Klenow片段，是由新英伦核子公司供应，E.Coli JMioi是从Dr.JoMessing，University of Minnesota(st.paul，Minnesots)处获得。限制性酶的酶解过程，T4DNA连接酶的连接及大肠杆菌E.Coli DNA多聚酶I，Klenow片段酶的反应都可以按制造商提出的步骤进行。对下列限制性酶的较佳缓冲液如下用于XbaI100毫摩尔Nacl，50毫摩尔Tris(三羟甲基氨基甲烷)pH7.5，10毫摩尔mgSO4;用于EcoRI，HindⅢ及SmaI50毫摩尔Nall，10毫摩尔Tris pH7.5，10毫摩尔mgSO4。T4DNA连接酶反应是在含在25毫摩尔Tris，pH8.0 10毫克Mgcl2，10毫摩尔dithiothritol(DTT)〔二巯基赤癣糖醇〕2毫摩尔亚精胺以及0.2毫摩尔ATp的缓冲液内进行，大肠杆菌E.Coli DNA多聚酶I，klenow片段酶，是在含有20毫摩尔Tris pH7.2，10毫摩尔Mgcl2，10毫摩尔(DTT)，1毫摩尔ATp，及1毫摩尔下列各物之一dATA，dGTp，dCTp，dTTq的缓冲液中使用。如果标记新合成的DNA链，则可加入Alpha-32p-dATp(400居里/毫摩尔)至Klenow反应液里。标记寡聚核苷酸是用伽马(γ)-32p-ATp(比活性大于5000居里/毫摩尔)及T4DNA激酶于100毫摩尔Tris，pH8.0 10毫摩尔MgCl2，5毫摩尔DTT。供b...
【专利技术属性】
技术研发人员：格温格拉博斯基克里瓦，
申请(专利权)人：孟山都公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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