本发明专利技术提供了一种生物法合成１，３－丙二醇的生产工艺，属于生物化工技术领域。本发明专利技术采用微生物好氧发酵，以兼性厌氧的克雷伯氏肺炎杆菌为出发菌株，依次含有以下步骤：克雷伯肺炎杆菌的种子活化；好氧条件下种子培养；微好氧条件下，以上述克雷伯肺炎杆菌菌体为生物催化剂，在发酵温度３０～５０℃，ｐＨ ７．０～９．０条件下，以葡萄糖辅助的甘油培养基进行发酵生产１，３－丙二醇，发酵１８～３６ｈ后结束发酵。利用本发明专利技术方法合成１，３－丙二醇具有生产周期短，生产强度高，发酵控制简单，操作方便，成本低的特点。
【技术实现步骤摘要】
,3-丙二醇的方法
本专利技术涉及一种生物法合成l， 3-丙二醇的方法，属于生物化工
技术背景1， 3-丙二醇y，3-Propanidio1)是一种重要的化工原料，可作为聚酯、 聚醚和聚氨酯的重要单体原料，是工业生物
研究的重要产品之一。由 1， 3-丙二醇合成的聚合物具有生物可降解性、安全无毒等许多其它二元醇合成 塑料所不具有的优良特性，不仅在服装和工程塑料领域得到应用，已作为食品、 药品和化妆品的包装材料开始应用。以1,3-丙二醇为原料合成的食品添加剂丙 二醇酯，作为世界六大食品乳化剂之一，目前也已被美国、日本和中国等国家 及欧盟、联合国粮农组织和世界卫生组织批准使用。1，3-丙二醇作为一种重要 的化工原料，还在油墨、印染、涂料、药物、润滑剂、抗冻剂等众多领域均具 有广泛的应用。生物法与化学法相比条件温和、操作简便、副产物少、无环境污染，已成 为各国研究的焦点，因此人们越来越倾向于利用可再生资源甘油为原料生物法 生产1,3-丙二醇。自1881年Auhust Freund发现巴斯德梭菌(Oo ^r2'^z'迎 psWewh朋咖)能够利用甘油合成1, 3-丙二醇以来，至今已发现多种微生物具有 在厌氧或兼性厌氧条件下利用甘油发酵生产1，3-丙二醇的能力，其中克雷伯氏 肺炎杆菌(Z7eAs"ieiJa ; / ei/M "/3e)、弗氏拧丰蒙菌(Cj'trc"Aactar /jre""a^j')及 丁酸梭状芽孢杆菌(67o^nV^ ^/^rici/顶)因具有较高的1,3-丙二醇转化率及 生产强度，是研究的最多的三种菌。利用肠道细菌将甘油歧化为1, 3-丙二醇的发酵方法为目前普遍采用发酵方 法，其发酵过程大多采用厌氧或好氧厌氧两步发酵(如USP5254467、 CN1955304A 和CN 1206362C等)，其生产过程中需要提供制氮设备，增加了固定设备投资和 能耗，过程控制较为繁琐，因此利用微氧或好氧发酵进行1， 3-丙二醇的生产逐 渐受到重视。研究发现，在微好氧或好氧条件下，兼性厌氧的克雷伯氏菌也可 以发酵甘油生产1,3-丙二醇，修志龙等开发了一种微生物微氧发酵生产1， 3-丙二醇的方法(CN 1204260C)，初步探索了在有氧条件下发酵生产1， 3_丙二醇 的工艺技术，但产物终浓度低。宫衡等(CN 101182552A)报道了在微氧条件下 通过对发酵液的渗透进行分阶段调控，提高产物浓度和生产强度。刘德华等发 明了一种微生物好氧发酵生产1,3-丙二醇的方法(CN1763210)，但该方法也存 在发酵周期相对较长，生产强度较低。与化学合成法相比成本偏高的问题。在 专利(CN 100999742A)中刘德华等改进上述方法，根据发酵过程中3-羟基丙醛 的检测值进行调控，产物终浓度有一定提高。但与化学法生产相比，微生物发 酵生产1，3-丙二醇技术仍需要继续在提高转化率、产品终浓度和生产强度，简 化发酵工艺控制，减少能耗，等方面开展研究，以降低生产成本提高其产品的 市场竞争力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供， 3-丙二醇的方法，以解决现有工 艺中转化率低，工艺复杂，成本高的问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术是一种生物法合成l， 3-丙二醇的方法，具体操作步骤如下1) 将甘油管保存的克雷伯氏菌(张根林等，Biochemical engineering Journal. 2007， 37:256-260)在无菌条件下接种到LB (Luria-Bertani)固 体培养基上，30 37。C活化培养8 12小时；2) 在上步培养后得到的固体培养基表面挑取单个菌落，在无菌条件下接入 到种子培养基中，30 4(TC摇床培养8 12小时，得一级种子液；得到的 一级种子在无菌条件下接入到种子培养基中，种子液接种量为培养基的 5 10°/。， 30 4(TC摇床培养8 12小时，得到二级级种子液；种子培养基 占培养容器体积的20 40%，摇床转速150 220rpm;3) 将发酵培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐体积的50% 80%，发酵培 养基110 12rC灭菌15min以上，搅拌冷却至室温后，在无菌条件下向发 酵罐中接入第二步制得的二级种子液进行发酵，发酵18 36小时后得到 目标产物；二级种子液占发酵培养基体积的5 15%，发酵温度30 5(TC， 搅拌转速150 料溶液为摩尔比为2 5: 1的甘油与氢氧化钾或 氢氧化钠混合溶液。所述步骤(1)中丄B培养基为每升中含酵母浸膏粉5g，蛋白胨10g，NaC15g， 琼脂15g，以酸或碱调节pH 6.5 7.5。所述步骤(2)中种子培养基为每升中含甘油15 60g，酵母粉0. 5 5g， (NH4) 2S04 3 10g， K2HP04 '3H20 4 8g， KH2P04 0. 5 3. 5g， MgS04 '7H20 0. l lg， CaCl2 'H20 0.01 0. lg，以酸或碱调节调节pH 7.0 9.0。所述步骤(3)中发酵培养基为每升中含甘油15 60g，酵母粉0. 5 5g， (NH4) 2S04 3 10g， K2HP04 *3H20 4 8g， KH2P04 0. 5 3. 5g， MgS04 *7H20 0. l lg， CaCl2 'H20 0.01 0. lg，微量元素溶液O. 1 5mL，铁溶液0.5 5mL，以酸或碱调节调节pH 7.0 9.0o其中每升铁溶液包括硫酸亚铁5g和浓盐酸4ml 。每升微量元素溶液包括MnS04 *H20 50 200mg， ZnCl250 100mg， Na2Mo04 *2H20 20 80mg， H3B03 50 100mg， CoCl2 6H20 10 300m， CuS04 5H20 20 80mg, NiCl2 6H20 50 100mg，浓盐酸0. 5 2 ml。所述步骤(3)中在每升发酵培养基中一次性添加辅助碳源葡萄糖或蔗糖等 2 20g，辅助碳源的添加促进菌体生物量的快速积累，縮短菌体发酵生产过程 中的延迟期，减少菌体生长对底物甘油的消耗，提高甘油对l， 3-丙二醇的转化 率。在发酵开始后间歇式通入无菌空气，通气时每次间隔30 60 min,每次通 气30 60 min，通气量1 5vvm,有利于二氧化碳等发酵代谢产物的及时排除 避免对发酵过程的干扰，提高l， 3-丙二醇生产强度和转化率。本专利技术的优点在于发酵培养基中添加辅助碳源，菌体生物量在发酵前期快 速积累，发酵周期短，生产强度高；同时补料通过在线发酵液pH调控完成，甘 油的流加时间和流加量仅由pH在线调控，可实现实时调控，不需要频繁取样， 避免染菌，易于操作，且避免底物和产物抑制。发酵采用间歇法通空气的好氧 发酵条件，有利于菌体的生长，能耗低；实验证明，该方法转化甘油合成1，3-丙二醇，生产强度达到2 4g/l h，甘油对1， 3-丙二醇的转化率达65%以上， 发具体实施例方式以下结合具体实施实例对本专利技术作进一步详细描述。应理解，以下实施例仅 用于说明本专利技术，而非用于限定本专利技术的范围。实施例11) 将甘油管中保存的兼性厌氧的克雷伯肺炎杆菌无菌条件下接种到LB (Luria-Bertani本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生物法合成１，３－丙二醇的方法，其特征在于具体操作步骤如下： １）将甘油管保存的克雷伯氏菌（张根林等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ．２００７，３７：２５６－２６０）在无菌条件下接种到ＬＢ（Ｌｕｒｉａ －Ｂｅｒｔａｎｉ）固体培养基上，３０～３７℃活化培养８～１２小时； ２）在上步培养后得到的固体培养基表面挑取单个菌落，在无菌条件下接入到种子培养基中，３０～４０℃摇床培养８～１２小时，得一级种子液；得到的一级种子在无菌条件下接入到种子 培养基中，种子液接种量为培养基的５～１０％，３０～４０℃摇床培养８～１２小时，得到二级级种子液；种子培养基占培养容器体积的２０～４０％，摇床转速１５０～２２０ｒｐｍ； ３）将发酵培养基装入发酵罐中，装液量为发酵罐体积的５０％～８０％， 发酵培养基１１０～１２１℃灭菌１５ｍｉｎ以上，搅拌冷却至室温后，在无菌条件下向发酵罐中接入第二步制得的二级种子液进行发酵，发酵１８～３６小时后得到目标产物；二级种子液占发酵培养基体积的５～１５％，发酵温度３０～５０℃，搅拌转速１５０～３００ｒｐｍ，发酵过程中发酵液ｐＨ值由发酵罐的ｐＨ在线监测装置检测，在发酵开始后１～２小时后通过发酵罐补料装置调节发酵液ｐＨ在７．０～９．０范围内，补料溶液为摩尔比为２～５∶１的甘油与氢氧化钾或氢氧化钠混合溶液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李春，徐小琳，张根林，马彬彬，吕波，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。