本发明专利技术公开了一种PA4-Fc的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明专利技术提供的蛋白，是如下1）或2）中任一所述的蛋白质：1）由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2）将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术通过优化密码子，构建表达PA4-Fc融合蛋白的DNA序列，将其通过载体导入细胞中，表达纯化出融合蛋白PA4-Fc；该融合蛋白可以抑制肿瘤细胞的生长，具有抗肿瘤效果。另外，由于含有人IgG1Fc片段，可延长其在体内的半衰期。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种PA4-FC的融合蛋白及其编码基因与应用。
技术介绍
炭疽(Anthrax)是由感染炭疽杆菌(Bacillus anthracis)而引发的一类传染性疾病。炭疽杆菌为革兰氏阳性芽孢杆菌，携带者为马、鹿等食草动物。人感染炭疽事件主要发生于那些经常接触动物的牧民和从事皮革工作的工人。引发炭疽感染的方式有三种:一是经皮肤感染，主要由炭疽芽孢从破损皮肤进入而致病，炭疽杆菌常聚集于皮肤破损处，这类感染常可恢复而不会引发严重后果。二是经胃肠道感染，常因食用含有芽孢污染的生肉而引发，这类感染常是致死性的，也是我国炭疽感染散发病例的主要感染方式。三是经呼吸道吸入感染，炭疽芽孢直径在5 y m以下，因此，芽孢经呼吸道吸入后可直达肺泡组织，而肺泡巨噬细胞可以吞噬芽孢，肺泡巨噬细胞目前被认为是炭疽芽孢的发芽位点，并且由此进入纵隔淋巴组织，在那里，炭疽杆菌快速弥散入血，如果不及时治疗，常可以引起100%的死亡。炭疽杆菌的致病因子主要集中在两个质粒上。一是pXOl质粒，主要表达保护性抗原(protective antigen, PA)、水肿因子(edema factor, EF)和致死因子(lethalfactor,LF)，三种蛋白统称为炭疽毒素(anthrax toxin)，其中PA是介导EF和LF进入宿主细胞的关键蛋白，也是炭疽疫苗研制的基础成分。LF是Zn2+依赖的蛋白激酶，可以阻断细胞内MAPK信号通路而导致细胞死亡，EF是Ca2+依赖的蛋白激酶，具有腺苷环化酶活性，可提高细胞内cAMP水平，引发细胞水肿并损伤细胞生理功能。炭疽杆菌的另一个毒力因子是PX02质粒，该质粒主要编码荚膜成分D-多聚谷氨酸，该成分能抑制巨噬细胞的吞噬作用，有利于细菌快速入血和向全身扩散，对炭疽芽孢杆菌的侵袭和感染具有重要作用。预防炭疽感染最经济有效的方法是注射炭疽疫苗，不管是已经上市使用的AVA疫苗，还是当前正处于临床研究或实验室阶段的疫苗研究，都表明炭疽杆菌保护性抗原PA是最理想的炭疽疫苗，其不仅能提供有效保护，而且适用年龄和安全性远高于传统AVA和减毒活疫苗。PA作为介导炭疽毒素进入细胞的“桥梁”分子，只要机体产生针对PA的特异性抗体，就可以阻止PA和其受体结合，从而阻断炭疽毒素进入细胞。PA根据其功能可分为四个结构域，第一部分(1-258AA)含有Ful in酶切位点和LF/EF结合位点，主要功能是介导PA63七聚体的自我组装和炭疽毒素进入细胞。第二部分(259-487AA)功能是介导PA前孔复合体向孔复合体的转换和辅助PA和其受体的结合，第三部分(488-595AA)在PA组装过程中也发挥一定作用，第四部分(596-735)为PA受体(TEM8和CMG2)结合部位。炭疽毒素PA有两个受体，一个是肿瘤内皮细胞标志物8 (tumorendothelialmarker8, TEM8),最初发现其在肿瘤血管系统和胚胎小鼠血管系统上有较高表达，因此命名为肿瘤血管内皮标志物，而cDNA表达分析和原位杂交分析显示在脑，心脏，肠，肺，骨骼肌和胰腺等组织中也有少量分布。 其天然功能未知。另外一个是毛细管形成蛋白 2 (capillary morphogenesis protein2, CMG2),最初在人的脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cells HUVECs)上发现,可能参与毛细血管的形成，故名CMG2，后来发现CMG2也表达于其它组织如心脏，肺，肝脏和骨骼肌等。PA和上述两个配体的结合均是通过其第四结构域来实现的。血管生成和肿瘤细胞转移是所有晚期恶性实体瘤发生和发展的必然过程。与血管生成和肿瘤细胞转移相关的关键分子自然成为研制肿瘤治疗药物的理想靶标，研制拮抗或阻断血管生成和肿瘤细胞侵袭转移的药物，应具有广谱抗肿瘤的活性。TEM8作为参与体内某些肿瘤生长的标志物分子，已有研究表明外源性给予可溶性的TEM8分子可以拮抗由体内肿瘤血管生产和肿瘤生长，而TEM8与人IgGFc构成的融合蛋白也表明具有很好的抑制肿瘤细胞生长，侵袭和血管生成的功能。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供PA4-FC的融合蛋白及其编码基因。本专利技术提供了一种蛋白，是如下I)或2)中任一种的蛋白质:I)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白质。上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。编码上述蛋白的DNA分子也是本专利技术保护的范围。上述DNA分子为如下I) -4)中任一所述的DNA分子:I)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子；2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述严格条件为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。上述序列I中自5’末端第61_486bp的核苷酸序列为PA4基因；序列I中自5’末端第487-2012bp的核苷酸序列为Fe基因(包含内含子)。上述序列3中自5’末端第l_60bp的核苷酸序列为信号肽；序列3中自5’末端第61-486bp的核苷酸序列为PA4基因；序列3中自5’末端第487-1182的核苷酸序列为Fe基因(不包含内含子)。 上述序列I所示的DNA分子和序列3所示的DNA分子均可编码序列表中序列2的氣基酸残基所不的蛋白。含有编码上述蛋白的DNA分子的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本专利技术保护的范围。上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中得到的重组载体，在本专利技术的实施例中，表达载体为pcDNA3.1，重组载体为将序列表中序列I所示的DNA分子插入pcDNA3.1载体的NheI和NotI酶切位点间得到的载体，命名为pcDNA3.l_PA4_Fc。上述转基因细胞系为将上述重组载体导入宿主细胞得到的转基因细胞系；在本专利技术的实施例中宿主细胞为CHO-Kl细胞或BHK-21细胞。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述的蛋白的方法，包括如下步骤:培养上述转基因细胞系，收集培养上清液，即得到上述的蛋白。上述培养为先在含10%肽牛血清的D-MEM/F-12培养基扩大培养，待细胞长满瓶壁后，更换为无血清培养基(D-MEM/F-12培养基)，隔天收细胞上清液；在收集上清液后还包括用亲和层析纯化回收目的蛋白，亲和层析纯化用ProteinA 亲和填料(rProtein A Sepharose4Fast Flow, GE 公司，产品编号 71-5900-09AC具体操作方法见产品说明书)，洗脱缓冲液用PH2.5、IOOmM的Gly-HCl (用天平称取7.5g甘氨酸溶解于本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白，是如下1）或2）中任一种的蛋白质：1）由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2）将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1）衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下I)或2)中任一种的蛋白质: 1)由序列表中的序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质； 2)将序列表中的序列2氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子为如下I)_4)中任一所述的DNA分子: 1)编码区为序列表中序列I 所示的DNA分子； 2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将权利要求2或3所述DNA分子插入表达载体中得到的重组载体。6.根据权利要求4所述的转基因细胞系，其特征在于:所述转基因细胞系为将权利要求4或5所述重组载体导入宿主细胞得到的转基...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡显文，郗永义，段海锋，高丽华，邵勇，陈惠鹏，胥照平，张连成，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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