本发明专利技术属于医药生物技术领域，涉及了一种肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFα的融合蛋白及其制备方法。将人肿瘤坏死因子氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro8Ser9Asp10突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，构建了高效低毒的重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFα。在此基础上，选用通过随机肽库技术筛选分离出的与肺特异性结合的多肽GFE-1，利用基因工程方法将其融合在rmhTNFα的氨基末端，制备的肺小血管内皮特异性结合多肽与rmhTNFα融合蛋白，能在肺组织特异性富集，从而提高肿瘤坏死因子的治疗特异性，减少全身用量，降低毒副反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物
，具体涉及一种肺小血管内皮特异性结合多肽GFE-1与重组改构人肿瘤坏死因子rmhTNFa的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白的表达、纯化及鉴定、体外活性检测及体内分布测定，以及对人肿瘤坏死因子的基因克隆、基因突变或重组改构、表达、鉴定等方面，还涉及利用所述融合蛋白制备抗肿瘤药物的方面。
技术介绍
1、肿瘤坏死因子相关研究肿瘤坏死因子a (TNFa )是一种由活化的单核细胞/巨噬细胞产生的具有多功能的炎症因子，一种多功能的细胞因子。肿瘤坏死因子α参与机体的免疫和代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用，是迄今为止人们所知道的抗肿瘤活性最强的细胞因子。1.1肿瘤坏死因子α的生物学活性TNFa是一种具有多种功能的炎症因子，在体内外发挥抗瘤、抗炎、免疫调节等多种作用，以下主要介绍它抗肿瘤相关的生物学活性。TNFa体内外均能杀伤某些肿瘤细胞或抑制其增殖作用。TNFa可通过诱导某些癌细胞凋亡来抑制肿瘤。TNFa具有细胞毒活性，多种肿瘤细胞对其敏感。TNFa在体内外均能杀伤某些肿瘤细胞或抑制增殖作用。肿瘤细胞株对TNFa敏感性有很大的差异，某些因素可增加细胞对TNFa杀伤的敏感性，如IFN、高温、转录或翻译的抑制剂，有丝分裂的抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，蛋白激酶抑制剂以及LiCl等。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞 (如小鼠成纤维细胞L929)可明显增强TNFa杀伤肿瘤细胞活性，此系统现在已经作为监测TNFa生物学活性的方法。在体内，TNFa还可以通过对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其他杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。TNFa作为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导天然细胞毒细胞、单核细胞和巨噬细胞，对癌细胞的杀伤和溶瘤作用。TNFa可作用于血管内皮细胞，对其增殖进行负调控，进而调节血管生成。并能启动血管损伤，引起肿瘤的血管内皮细胞损伤，不能调控血栓形成，从而导致肿瘤组织的局部血流阻断，发生出血性坏死或因营养缺乏而消退。TNFa的最大耐受剂量很低，因此常伴随发热、肌肉酸痛、流感样症状等副反应，严重限制了其临床应用。但是人们并没有停止对TNF α的研究，目前多通过构建变构体的形式以避免或减轻副作用、增加人体耐受性从而提高治疗效果。1.2TNFa的变构体TNF α活性三聚体的间沟是由近N端和近C端的极性基团及中部的疏水基团所组成的，而这些亚单位之间的沟是TNF与其受体结合的部位。实验表明，C端上最后一个氨基酸Leul57改变成Phe，met或者Glu，能提高其活性18倍左右，因为这种改变使疏水性的TNF-a亚单位之间的结构变得更紧凑，从而提高了 TNFa同受体结合的效率。另外，缺失1-7个N端的氨基酸，增加了 TNF-a的碱性度，提高了和受体的亲和力，活性增加了 5倍。不仅如此，N端的8，9，10和17个氨基酸变成碱性氨基酸，使某些对野生型TNFa不敏感的细胞变得敏感了，扩大了 TNFa的疗效范围，而且还增强了其抗肿瘤的活性。细胞水平和动物试验上的实验数据显示这些变构体不仅提高了同受体的结合能力，还增加了其摧毁肿瘤周围血管上皮组织的能力。另外，变构体引起的毒副作用也要比野生型TNFa低18倍。国内多家研究机构对TNFa变构体进行研究，已有多种TNF α变构体进入了临床研究阶段。专利技术人通过基因工程方法，将氨基端7个氨基酸残基去除，并将Pro8Ser9Aspw突变为Arg、Lys和Arg，同时把Leu157突变为Phe，改构后的TNF α比天然TNF α体外杀伤L929细胞的活性增加1000倍左右，在体内肿瘤出血坏死效应也明显增加，比单独缺失N端七个氨基酸或者单独突变157位氨基酸的活性升高的都要大，且新型重组人肿瘤坏死因子毒性比天然肿瘤坏死因子降低三倍。原因是N端的氨基酸碱性增强可扩大抗瘤谱，而C端的最后一个氨基酸被替代，疏水性增强，使三聚体更为稳定。较天然肿瘤坏死因子活性提高了 1000倍，而毒性却为天然肿瘤坏死因子的1/3。临床试验结果表明，rmhTNFa对非小细胞肺癌、黑色素瘤和头颈部肿瘤具有明显的治疗作用。已获得国家食品药品监督局的新药证书。2、特异性多肽研究现状利用噬菌体展示技术构建的随机肽库可用于筛选与某个靶细胞特异性结合的多肽。即通过确定表达在不同肿瘤细胞或组织器官上特异性分子的结合肽，并以此结合肽为载体与药物相连，这样可以有效地提高定向传递治疗药物的能力。随机肽 库技术在抗肿瘤领域的研究主要集中于以下几种方式:1.用于筛选已知肿瘤抗原的特异性结合肽，主要是针对肿瘤细胞膜分子常常出现的异常糖基化现象，这些特异性糖类可以作为肿瘤导向治疗的目标受体。2.用于筛选与肿瘤转移有关的粘附分子的特异性结合肽，如RGD多肽通过识别整合素，已成为抑制肿瘤细胞迁移及粘附的新治疗靶点。3.用于筛选组织特异性结合肽用特定的组织和细胞，对随机肽库进行多轮淘洗时，可以筛选出大量结合在细胞表面受体分子上的肽。再通过多种有效的方法减少一些噬菌体群的复杂性后，可以得到特异性结合于该组织的肽。4.用于筛选肿瘤附属组织的特异性结合肽。特异性多肽分子量小，构建简单，免疫原性更低，应用其作为导向载体是一个很好的研究策略。目前的研究结果显示:将特异性多肽与抗肿瘤药物联合使用，可提高后者抗肿瘤效率并降低其全身的毒副作用。随机肽库技术在肿瘤导向治疗中也渐渐发挥着重要的作用。GFE-1就是我们通过噬菌体随机肽库技术分离出的可与肺特异性结合的多肽，含有13个氨基酸(CGFECVRQCPERC)及2个潜在二硫键。实验分离得到的GFE-1的受体经蛋白序列鉴定与MDP (membrane dipeptidase)—致,且证实该受体在肺组织的分布远高于其他组织。3、GFE-1 及其受体3.1GFE-1GFE-1显示出比对照高35倍的特异性与肺结合的能力，含13个氨基酸及2个潜在二硫键，GFE-1的结合可被共轭多肽所阻断。另一个与肺结合的多肽GFE-2与GFE-1有相同的三肽模序。呈现GFE-2多肽的噬菌体也可在肺的血管发现，它结合于肺并被GFE-1多肽抑制，GFE-1及GFE-2主要结合在毛细血管而不是更大血管。GFE-1及GFE-2多肽都可以结合于相同的受体，GFE-1的结合作用强于GFE-2。这个受体选择性地表达在血管。3.2GFE-1 的受体Daniel Rajotte等分离出这个肺特异性多肽GFE-1的受体,蛋白序列鉴定了这个受体与MDP—致，MDP是一个多功能的蛋白，它可与脂蛋白，特别是高密度脂蛋白结合，通过参与维生素E的代谢而影响肺泡II型细胞功能，从而影响抗炎，细胞凋亡及肺泡表面活性剂合成等肺功能。它特异性的分解Cys-Gly键，有意义的是，GFE-1和GFE-2多肽的第1，2位氨基酸是Cys-Gly。它们可以结合到MDP的活性部位从而抑制MDP的酶解活性。它是MDP的竞争抑制剂。噬菌体颗粒呈现GFE-1肽段选择性地结合在转染鼠MDP cDNA的C0S-1细胞。MDP在肺，肾等几种器官表达，主要表达在肺和肾。MDP在肺部主要表达在支气管及肺泡上皮、毛细血管、肺泡及终末细支气管的基膜。在肾分布于近球小管刷状缘区。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肺小血管内皮特异性结合多肽GF本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组的、分离的或合成的融合蛋白GFE?1?rmhTNFα，其特征在于，该融合蛋白包括：1）肺小血管内皮特异性结合多肽（GFE?1），或具有GFE?1活性的片段或变体；2）经过重组改构而获得的人肿瘤坏死因子（rmhTNFα）或其片段或变体，所述重组改构改善其蛋白活性。
【技术特征摘要】
1.重组的、分离的或合成的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其特征在于，该融合蛋白包括: 1)肺小血管内皮特异性结合多肽(GFE-1)，或具有GFE-1活性的片段或变体； 2)经过重组改构而获得的人肿瘤坏死因子(rmhTNFa)或其片段或变体，所述重组改构改善其蛋白活性。2.权利要求1所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFa，其中所述肺小血管内皮特异性结合多肽(GFE-1)的基因序列为⑴ (6)中任一种: (I)SEQ ID NO:1所示的序列； ⑵DNA分子，其编码与SEQ ID NO:1所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽； ⑶与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列； (4)与SEQID NO:1所示序列互补的序列； (5)由于遗传密码的简并性而衍生自SEQID NO:1所示序列的序列之一； (6)编码SEQID NO:2所示氨基酸序列的基因序列。3.权利要求1或2所述的融合蛋白GFE-1-rmhTNFα，其中所述人肿瘤坏死因子CrmhTNFa )的基因序列为① ⑥中任一种: ①SEQID NO:3所不的序列； ②DNA分子，其编码与SEQID NO:3所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个氨基酸残基的保守替代的多肽； ③与SEQID NO:3所示的序列具有至少90%序列同一性的DNA分子或编码其活性片段的序列； ④与SEQID NO:3所示序列互补的序列； ⑤由于遗传密码的简并性而衍生自SEQID NO:3所示序列的序列之一； ⑥编码SEQID NO:4所不氣基酸序列的基因序列。4.权利要求1至3任一所述的融合蛋白GFE-l-r...
【专利技术属性】
技术研发人员：李维娜，张阔，薛晓畅，李萌，张存，郝强，王增禄，张伟，张英起，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：
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