肉鸭细小病毒精制卵黄抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，涉及抗体领域，针对现有对肉鸭细小病毒缺乏有效预防和治疗的问题提出本方案，主要包括疫苗制备、疫苗免疫程序、卵黄抗体提取，以实现对肉鸭细小病毒预防和治疗的功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，主要涉及抗体领域。
技术介绍
2014年11月以来，我国部分地区肉鸭流行一种以临床症状为鸭喙发育不良，舌头外露、肿胀、向下弯曲，发病率为10-30%，鸭发病日龄集中在2个阶段，第一阶段为3?13日龄，症状为站立不稳，蹼外翻，强行驱赶时跛行或翻滚;第二阶段为21?28日龄，主要为运动障碍，跟不上大群，呈蹲坐式或侧卧，并表现出舌头外露症状，患病鸭料肉比比正常鸭高30%以上，同日龄出栏体重比正常鸭低20%以上，且发育不整齐，屠宰时易翅膀和腿骨折为特征的疾病。禽病专家刁有祥等最先分离到病原，基因序列鉴定与鹅细小病毒同源性大于98%，与番鸭细小病毒同源性为77%左右，命名为鸭细小病毒。常规治疗方法基本无效，对鸭养殖业造成巨大经济损失。
技术实现思路
针对以上现有技术的不足，本专利技术提出一种的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是:第一步，将分离得到的肉鸭细小病毒经易感鸭胚传代12代获得作为毒种，然后将得到的肉鸭细小病毒用生理盐水20000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60?120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格后得到抗原；第二步，抗原加终浓度为0.1%甲醛，37°C灭活24小时；于4°C经4000转/分钟离心30分钟，收集上清液，上清液用超滤器浓缩15倍，浓缩液转入灭菌容器灭活检验合格后得到制备疫苗用抗原制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5yg/ml，即为鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗，无菌操作分装，于2?8 °C保存；第三步，选取商品蛋鸡进行抗原接种和收集高免鸡蛋，对高免鸡蛋进行消毒、分离卵黄、抗体的萃取和过滤。进一步，第一步中得到的抗原，要进行病毒含量、纯净性、特异性和免疫原性进行鉴定。进一步，抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10—5、10—6和10—73个稀释度接种9日龄易感鸭胚，每个稀释度各接种5枚，每一胚胎0.1ml，用蜡封孔，于37.5 V静置孵化，24小时以前死亡的鸭胚弃去不计，收集24?168小时死亡鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10一6.25ELD50A).lml。进一步，免疫原性按如下进行免疫接种:对100?110日龄商品蛋30只进行接种，同时设10只对照，不做任何处理，免疫程序如下:基础免疫每只鸡腿部肌肉注射1.0ml。加强免疫在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml。强化免疫在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml。进一步，选取100-120日龄蛋鸡进行灭火抗原接种:维持免疫:当卵黄中鸭细小病毒琼扩抗体效价临界I: 32时，维持接种I次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2.0ml。强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，检测鸭细小病毒琼扩抗体效价大于等于I: 32为合格，收集高免鸡蛋，8?12°C贮存，应不超过10日。进一步，充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入灭菌搅拌罐中，按体积比1:3加入25°C左右、pH为4.7的灭菌注射用水，搅拌30分钟，将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4%正辛酸，继续搅拌30分钟，室温放置12?24小时，用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，收集滤液，滤出液和下层液体合并，用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，然后转入用0.2%甲醛溶液消毒的500L冰柜中，4°C冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，用0.2M氢氧化钠溶液调pH7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节PH6.9，即为抗体半成品。进一步，抗体半成品加入终浓度0.05%甲醛，用过滤精度0.2μπι的筒式滤芯过滤除菌。本专利技术的有益效果如下:将本技术方案正确的运用，用于预防，可阻断病毒感染，临床保护率大于93%以上;用于治疗，在发病3-5日以内及时使用抗体治疗，鸭体重低于Ikg的，按1.5ml/只；大于Ikg体重以上的，按1.2ml/kg体重。一般用药I次，3天后病鸭临床发病症状消失，配合抗生素来控制细菌继发感染效果更佳，小于10日龄发病的商品雏鸭愈后发育良好、后期出现喙短、舌头外翻症状的比例小于10%，基本不影响经济价值;但发病日龄超过10天的，对已形成喙短舌头突出的症状不能逆转。本专利技术制备的肉鸭细小病毒精制卵黄抗体为临床预防、治疗该病提供了有效手段，能显著减少该病给肉鸭养殖业带来的经济损失。【具体实施方式】实施例I肉鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗制备K1抗原制备肉鸭细小病毒，由公司研究人员于2015年I月从山东聊城某肉鸭养殖场分离到的肉鸭细小病毒，经易感鸭胚传代12代、鉴定获得。肉鸭细小病毒用生理盐水20000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60?120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格，即为抗原，于-40 °C保存。同时取样用于鉴定。1.2抗原鉴定1.2.1病毒含量抗原用生理盐水10倍系列稀释，取10—5、10—6和10—73个稀释度接种9日龄易感鸭胚，每个稀释度各接种5枚，0.1ml/胚，用蜡封孔，于37.5 °C静置孵化，24小时以前死亡的鸭胚弃去不计，收集24?168小时死亡鸭胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10—6.25ELD5q/0.1ml。1.2.2纯净性抗原按照现行《中华人民共和国兽药典》进行细菌、支原体和外源病毒检验合格。1.2.3特异性抗原用生理盐水稀释至200ELD5Q/0.1ml，与等量抗肉鸭细小病毒特异性血清混合，37 0C水浴中和I小时，尿囊腔接种9日龄易感鸭胚1枚，0.1ml /胚；同时设病毒对照1枚，接种同条件处理的病毒与生理盐水混合液0.1ml/枚，上述鸭胚用蜡封孔，于37°C静置孵育，观察至168小时。中和组鸭胚全部健活，对照组鸭胚全部死亡。说明抗原能被抗肉鸭细小病毒特异性血清中和。1.2.4免疫原性1.2.4.1抗原灭活抗原加终浓度为0.1 %甲醛，37°C灭活24小时，期间振摇4次，每次3分钟。1.2.4.2灭活检验1.2.4.2.1无菌按照现行《中华人民共和国兽药典》检验，应无细菌生长。1.2.4.2.2安全检验灭活抗原皮下或肌肉注射5日龄肉鸭10只，1.0ml/每只。饲养观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。1.2.4.2.3免疫接种灭活抗原按如下免疫程序接种100?110日龄商品蛋30只，同时设1只对照，不做任何处理，免疫程序如下:基础免疫每只鸡腿部肌肉注射1.0ml。加强免疫在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.5ml。强化免疫在加强免疫后15日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射2.0ml。1.2.4.2.4抗体提取强化免疫后10日分别收集鸡蛋，分离卵黄，按组混合，搅拌成膏状，加入3倍体积的生理盐水，充分搅匀，加入终浓度20 %的氯仿，剧烈震荡20分钟，于4°C条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌即为抗体样品。1.2.4.2.5琼脂扩散试验检测用抗原的制备抗原300ml加入终浓度为20%的氯仿，剧烈振摇20分钟，于4°C条件下4000rpm离心20分钟，收集上清液，过滤除菌，滤液加入透析袋中，用夹本文档来自技高网...

【技术保护点】
肉鸭细小病毒精制卵黄抗体，其特征在于，其制备流程包括以下：第一步，将分离得到的肉鸭细小病毒经易感鸭胚传代12代获得作为毒种，然后将得到的肉鸭细小病毒用生理盐水20000倍稀释，经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，0.1ml/胚，收集接种60～120小时死亡鸭胚尿囊液，无菌检验合格后得到抗原；第二步，抗原加终浓度为0.1％甲醛，37℃灭活24小时；于4℃经4000转/分钟离心30分钟，收集上清液，上清液用超滤器浓缩15倍，浓缩液转入灭菌容器灭活检验合格后得到制备疫苗用抗原制备疫苗用抗原加入鸭白细胞介素2，使鸭白细胞介素2终浓度为5μg/ml，即为鸭细小病毒白细胞介素2佐剂灭活疫苗，无菌操作分装，于2～8℃保存；第三步，选取商品蛋鸡进行抗原接种和收集高免鸡蛋，对高免鸡蛋进行消毒、分离卵黄、抗体的萃取和过滤。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：魏思远，赵光伟，
申请(专利权)人：重庆三杰众鑫生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85