鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种鸭呼肠孤病毒SL株，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201970，以解决现有技术中的中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防、治疗无明显效果的技术问题。鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物的使用能解决临床鸭呼肠孤病毒的防控难题，带动养殖户增收，为我国鸭养殖业健康发展保驾护航，具有显著的经济效益和社会效益。

【技术实现步骤摘要】
鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用
本专利技术涉及一种鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用。
技术介绍
2014年以来，在我国鸭养殖业中流行一种临床发病症状为精神沉郁，缩颈垂翅，脚软无力、喜蹲伏，腹泻排出白色或绿色稀便；死亡鸭病理变化主要为肝脏、脾脏有坏死灶的疾病，临床称为鸭“肝脾坏死症”，病原经确诊为鸭呼肠孤病毒。自然临床疾病发生于鸭、鹅、番鸭和半番鸭[1]，麻鸭、鹅、番鸭和半番鸭的易感性相当，但樱桃谷鸭、北京鸭等肉用型鸭的易感性更高，如樱桃谷鸭和北京鸭一旦感染鸭呼肠孤病毒，1周龄以内鸭发病率为50％以上，全群死亡率10％左右，1-2周龄鸭的发病率30％左右，死亡率5％左右，3-4周龄鸭发病率和死亡率分别低于30％和5％，4周龄以上鸭零散发病和死亡，耐过鸭发育不良，整齐度差，料肉比高[2]，2016年以来该病在国内主要鸭养殖区呈爆发流行趋势，给我国鸭养殖业造成了巨大经济损失，如重庆三杰众鑫生物工程有限公司研究人员2018年7月通过对安徽某鸭业集团有限公司和江苏某集团有限公司的商品樱桃谷鸭养殖场的鸭“肝脾坏死症”流行病学调查统计发现，上述两个鸭养殖集团2018年上半年共计孵化樱桃谷雏鸭约3.76亿只，发生“肝脾坏死症”死亡鸭高达约1362.7万只，平均死亡率3.62％。有研究表明[3]中药多糖对呼肠孤病毒有一定的预防效果，如与同居感染对照组番鸭死亡率24％比较，猴头菇多糖预防组和黄芪多糖预防组的番鸭发病死亡率分别为12％和4％，且番鸭的发病临床症状较缓和，剖检病变轻，尤为试验后期。在2018年1-6月，上述两个养殖集团使用有正规批文的中兽药如“清瘟解毒口服液”、“鱼腥草芩蓝口服液”、“公英青蓝合剂”、“双黄连口服液”等在上批次养殖过程中发生过“肝脾坏死症”的16个商品鸭养殖场进行预防或治疗“鸭肝脾坏死症”试验，其中用于预防的试验场12个，用于治疗的试验场4个。预防方法：因该病的潜伏期为3-5日，高发日龄为6-10日龄，故在雏鸭1日龄开始，在饮水中按说明书中的用法用量添加中药至10日龄，与同批次不用中药预防的对照组比较，雏鸭的发病日龄、发病率和死亡率与均差异不显著(P>0.05)；治疗方法：在雏鸭出现临床症状后即按说明书中的用法用量进行治疗，连用5日，疗程结束后再观察5日，而后统计全群死亡率，以该场上批次发生“肝脾坏死症”的同期死亡率为对照，结果显示用上述农业部批准生产的中兽药预防、治疗鸭呼肠孤病毒的效果差异不显著(P>0.05)。结论：的预防和治疗基本无效。肝脏的主要功能是分泌胆汁、储藏糖原，调节蛋白质、脂肪和碳水化合物的新陈代谢等，还有解毒、造血和凝血作用；脾脏是最大的免疫器官和血液过滤器官，对调节机体免疫反应起到重要作用。中草药的防治疾病作用[4]主要依靠调动动物体内非特异性抗菌抗病毒积极因素如细胞吞噬、抗体、细胞因子、自然杀伤性细胞等来增强免疫功能而实现的。导致某些中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防治疗效果不明显的主要原因可能与该病毒的作用靶器官为肝脏和脾脏，病毒感染导致肝脏细胞变性坏死，肝细胞体积增加、细胞核固缩，细胞内充满空泡性变性，肝广泛性出血，肝窦间隙增大，淋巴细胞浸润和脾脏脾小体中央动脉扩张，脾小体和动脉周围淋巴组织鞘界限不清，结构疏松，巨噬细胞增多，脾出血充血严重有关[5]。病毒感染导致鸭主要免疫调节器官-肝脾坏死，进而影响机体代谢和免疫功能，导致某些中兽药这种间接抗病毒作用无法发挥。鉴于农业部已禁止抗病毒西药如金刚烷胺、利巴韦林、病毒灵等在畜禽上的使用[6]和大多数的中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防、治疗无明显效果，根据病毒病的有效预防方法为接种疫苗和特异性抗体、治疗的方法为紧急注射特异性抗体的已知手段，减少鸭呼肠孤病毒造成的损失应以预防为主，从而避免发病后因鸭死亡造成的直接经济损失和治疗用药成本、后续因疾病感染而导致的耐过鸭发育不良，整齐度差，料肉比高的间接损失，故研制一种能有效预防鸭呼肠孤病毒的疫苗或预防、治疗鸭呼肠孤病毒的特异性卵黄抗体迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用，以解决现有技术中的中兽药对鸭呼肠孤病毒的预防、治疗无明显效果的技术问题。本专利技术提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种鸭呼肠孤病毒SL株，该鸭呼肠孤病毒SL株的部分基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，与Genbank上其他鸭呼肠孤病毒比较，基因序列同源性为89.97％-94.53％，处于一个独立的进化分支，为新毒株，该毒株免疫原性良好，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:V201970。本专利技术的第二目的是提供一种鸭呼肠孤病毒SL株的鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物，其制备方法包括下述步骤：A、将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株进行病毒繁殖，制备抗原，具体步骤为：A1、接种：将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株用灭菌生理盐水1000倍稀释，按每胚0.2mL经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，然后用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育；A2、孵育和观察：观察步骤①中进行静置孵育的鸭胚，弃去48h内死亡鸭胚，收集48～120h死亡鸭胚，然后于4℃冷却6～12h；A3、收获：对步骤②中冷却鸭胚的用75％的酒精对蛋壳进行消毒，并用碘酊再次对蛋壳表面气室部消毒，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存；其中，抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.2mL。B、将步骤A中制备的抗原制备鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体，步骤包括：B1、抗原浓缩与灭活：抗原于2～8℃条件下解冻、混合批组，加入终浓度为4.8％(V/V)氯仿，振摇10min，于4℃条件下4000r/min离心30min，取上清液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤柱浓缩5倍，浓缩液加入终浓度为0.2％(V/V)的甲醛溶液，置37～37.5℃温箱中灭活24h，其间4～6h振摇1次，每次3分钟，于2～4℃保存；B2、免疫抗原的制备：油相制备，取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压灭菌30min，冷却至室温；水相制备，灭活抗原96份加入4份灭菌的吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解；乳化、油相与水相按体积比2:1的比例初步混合、振摇3～5分钟，加入均质机料斗，调节压力为34～37MPa进行乳化，检验合格以后分装标记，于2～8℃保存；B3、高免鸡蛋生产：产蛋鸡按基础免疫、加强免疫、强化免疫、维持免疫，强化免疫后7日，抽样取蛋检测鸭呼肠孤病毒卵黄中和抗体效价≥1:512为合格，收集鸡蛋，于湿度30～60％、温度10～15℃条件下避光储存；B4、鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体制造：将蛋壳有粪污的高免鸡蛋单独挑出，用自来水清洗干净，与蛋壳洁净的高免鸡蛋一起摆入塑料蛋盘中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭呼肠孤病毒SL株，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:V201970。/n

【技术特征摘要】
20200509 CN 202010388016X1.一种鸭呼肠孤病毒SL株，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo:V201970。


2.根据权利要求1所述鸭呼肠孤病毒SL株，其特征是，所述鸭呼肠孤病毒SL株的部分基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.一种含有权利要求1所述鸭呼肠孤病毒SL株的鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物。


4.根据权利要求3所述鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物的制备方法，其特征是，包括下述步骤：
A、将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株进行病毒繁殖，制备抗原；
B、将步骤A中制备的抗原制备鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体；
C、以蜂胶粉为原料制备鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原；
D、以步骤B中制备的鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体和步骤C中制备的鸭呼肠孤病毒蜂胶佐剂抗原按1:1比例混合均匀，即得鸭呼肠孤病毒抗原抗体复合物成品。


5.根据权利要求4所述制备方法，其特征是，所述步骤A中抗原的制备步骤为：
A1、接种：将权利要求1中所述的鸭呼肠孤病毒SL株用灭菌生理盐水1000倍稀释，按每胚0.2mL经尿囊腔接种11日龄易感鸭胚，然后用蜡封孔，于37～37.3℃静置孵育；
A2、孵育和观察：观察步骤①中进行静置孵育的鸭胚，弃去48h内死亡鸭胚，收集48～120h死亡鸭胚，然后于4℃冷却6～12h；
A3、收获：对步骤②中冷却鸭胚的用75％的酒精对蛋壳进行消毒，并用碘酊再次对蛋壳表面气室部消毒，无菌操作除去气室部蛋壳，收获胚液，置于灭菌容器内，标记，即为抗原，置-20℃保存。


6.根据权利要求5所述制备方法，其特征是，所述步骤A1中制备的抗原的病毒含量≥10-5.0ELD50/0.2mL。


7.根据权利要求4所述制备方法，其特征是，所述步骤B中鸭呼肠孤病毒精制卵黄抗体的制备步骤为：
B1、抗原浓缩与灭活：抗原于2～8℃条件下解冻、混合批组，加入终浓度为4.8％(V/V)氯仿，振摇10min，于4℃条件下4000r/min离心30min，取上清液用截留分子量为6KD的中空纤维超滤柱浓缩5倍，浓缩液加入终浓度为0.2％(V/V)的甲醛溶液，置37～37.5℃温箱中灭活24h，其间4～6h振摇1次，每次3分钟，于2～4℃保存；
B2、免疫抗原的制备：油相制备，取94份注射用白油，加入2份硬脂酸铝，边加边搅拌，加热直至完全透明，再加入6份司本-80，充分混匀，121℃高压灭菌30min，冷却至室温...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立武，魏思远，赵光伟，杨晓伟，
申请(专利权)人：重庆三杰众鑫生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50