本发明专利技术公开了一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体RDP‑VP‑19001及其应用,其宿主为沙门氏菌S6，透过电镜观察，该噬菌体头部为廿面体，且立体对称，短尾，噬菌体长度为78.889nm，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科，基因全长74730bp，不具有毒力基因和溶原性基因，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物学中心，保藏日期为2020年8月27日，保藏编号CGMCC No.19980。溶藻弧菌噬菌体RDP‑VP‑19001对水体中溶藻弧菌具有强裂解作用，具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，可以高效治疗该病原菌在水产养殖中所引起的溶藻弧菌疾病，以及可以作为消毒剂，为工业化、规模化、程序化生产噬菌体及治疗溶藻弧菌引起的水产养殖动物细菌病提供了噬菌体来源。
【技术实现步骤摘要】
一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001及其应用
本专利技术涉及微生物领域，特别是涉及一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001及其应用。
技术介绍
溶藻弧菌为革兰氏阴性短杆菌，具有嗜盐性，无芽孢、荚膜，隶属于弧菌科、弧菌属，是一种常见海洋致病菌，广泛分布于世界各地的海水和河口处，在海水类弧菌中数量最多。溶藻弧菌是一种重要的伺机性病原体和人畜共患病原菌，在人体和养殖水产动物上能够引起各种不同症状的弧菌病，溶藻弧菌在鱼、虾、贝等海水养殖动物中是一种条件致病菌，当环境恶化和机体免疫机能下降时，溶藻弧菌病容易爆发，多发生在夏季，爆发时往往会造成水产养殖业巨大经济损失。同时，溶藻弧菌对人的健康也易造成伤害，可以引起伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病。噬菌体是一类以细菌为宿主的病毒，广泛存在于自然界，专一性、自我裂解能力强，具备裂解细菌和控制细菌生长的功能，可以调节自然界中细菌的消长，用溶藻弧菌噬菌体作为生物杀菌剂预防、治疗和控制在水产养殖过程中的溶藻弧菌细菌病，具有低污染、高效率的优势，在一定程度上减少人为活动对自然界的影响。本专利技术通过致病性溶藻弧菌的分离，进而分离出一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体，并研究了其生物学特性，扩充了噬菌体储备库为开发治疗溶藻弧菌的抗生素替代品奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一株治疗溶藻弧菌病、且安全可靠的高裂解性溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001，提供一株生产该噬菌体的病原菌溶藻弧菌，同时提供了一种该噬菌体的分离方法。该噬菌体RDP-VP-19001保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西区1号院3号，保藏日期为2020年8月27日，保藏编号CGMCCNo.19980。本专利技术的另一目的在于提供该噬菌体在治疗人体或水产溶藻弧菌病中的应用，RDP-VP-19001具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，效价较高，安全有效，有利于工业化生产。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一株高裂解型溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001，其宿主为沙门氏菌S6，透过电镜观察，该噬菌体头部为廿面体，且立体对称，短尾，噬菌体长度为78.889nm，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科，基因全长74730bp，不具有毒力基因和溶原性基因，保藏编号CGMCCNo.19980。进一步地，溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001对水体中溶藻弧菌具有强裂解作用，裂解率达98%，为工业化、规模化、程序化生产噬菌体及治疗溶藻弧菌引起的水产养殖动物细菌病提供了噬菌体来源。进一步地，噬菌体RDP-VP-19001在pH为6-9范围内作用1小时，其效价在5.9×106pfu/mL之上，适合生长在中性环境中。进一步地，噬菌体RDP-VP-19001在pH=12时，效价达到103pfu/mL，在pH=4时，仍有噬菌体存活，噬菌体的酸碱耐受范围宽。进一步地，噬菌体RDP-VP-19001的最适温度为37℃，效价最高达到109pfu/mL.进一步地，该噬菌体在-80℃的条件下可长期保存，效价维持稳定；在70℃的条件下作用20min，效价维持在102pfu/mL，依然具有生物活性。进一步地，该噬菌体可高效感染溶藻弧菌，其最佳感染复数为10。进一步地，该噬菌体RDP-VP-19001用于水产养殖环境的消毒。进一步地，该噬菌体作为消毒剂用于水体环境消毒。进一步地，水体中加入噬菌体RDP-VP-19001后，3小时内有明显的裂解效果。本专利技术的有益效果体现在：（1）本专利技术发现并分离了一种溶藻弧菌，并以该溶藻弧菌为宿主分离得到了噬菌体RDP-VP-19001，该噬菌体RDP-VP-19001对水产养殖环境中溶藻弧菌具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中溶藻弧菌的防治提供了噬菌体来源；（2）在本专利技术中，噬菌体RDP-VP-19001在pH为6-9范围内作用1小时，其效价在5.9×106pfu/mL之上，适合生长在中性环境中；在pH=12时，效价达到103pfu/mL，在pH=4时，仍有噬菌体存活，噬菌体的酸碱耐受范围宽。（3）该噬菌体在-80℃的条件下可长期保存，效价维持稳定；在70℃的条件下作用20min，效价维持在102pfu/mL，依然具有生物活性。（4）当水体中加入噬菌体RDP-VP-19001后，3小时内有明显的裂解效果，可作为消毒剂用于水体环境的消毒。（5）通过对本专利技术分离得到的噬菌体的生物学特性研究，为下一步研发新的抑菌药物提供理论指导意义。附图说明本专利技术上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：图1为电镜观察本专利技术分离得到的噬菌体的形态示意图；图2为本专利技术噬菌体一步生长曲线示意图；图3为本专利技术噬菌体pH稳定性实验的示意图图4为本专利技术噬菌体热稳定性实验的示意图。具体实施方式本专利技术使用从青岛的海参池污泥中分离的致病性溶藻弧菌BV-19002，通过实验确定BV-19002的致病性，以BV-19002为宿主，从环境中分离得到一株裂解性溶藻弧菌噬菌体，并通过全基因组序列确定了RDP-VP-19001的基因型。下面将结合附图和实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下面实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1溶藻弧菌的分离鉴定从具有溶藻弧菌细菌性疾病的海参池的污泥中取样，采用无菌操作的方法，在TCBS琼脂培养基中划线，37℃培养19h-23h后，在培养基中呈现圆形且边缘整齐的绿色光滑菌落，直径约2-4mm；然后挑取典型菌落在科玛嘉弧菌显色培养基上划线，37℃培养19-23h后，在科玛嘉弧菌显色培养基上呈现无色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化4次，然后挑取单菌落接种于5mL的2216E液体培养基中，37℃、170rpm振荡培养4h，得到均匀浑浊的细菌增殖液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为溶藻弧菌，将其中一株命名为BV-19002。实施例2溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001的分离鉴定本专利技术实验用污泥样品为2018年从青岛海参养殖场中的海参池中采集，作为噬菌体分离的样品。（1）取污泥5g加入10g已灭菌的纯化水，10000rpm离心5min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。取3ml滤液和3ml处于对数生长期的宿主菌培养液，一起加入到20ml高压灭菌处理的2216E液体培养基中，静置于37℃培养箱中，过夜培养，对可能存在的噬菌体进行增殖。取样品培养液3ml，10000rpm离心5min,取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。假设上述滤液中含有噬菌体。用2216E液体培养基进行梯度稀释，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001，其宿主为沙门氏菌S6，透过电镜观察，该噬菌体头部为廿面体，且立体对称，短尾，噬菌体长度为78.889nm，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科，基因全长74730bp，不具有毒力基因和溶原性基因，保藏编号CGMCC No. 19980。/n
【技术特征摘要】
1.一株高裂解性溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001，其宿主为沙门氏菌S6，透过电镜观察，该噬菌体头部为廿面体，且立体对称，短尾，噬菌体长度为78.889nm，为有尾噬菌体目短尾噬菌体科，基因全长74730bp，不具有毒力基因和溶原性基因，保藏编号CGMCCNo.19980。
2.根据权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001，其特征在于，溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001对水体中溶藻弧菌具有强裂解作用，裂解率达98%，为工业化、规模化、程序化生产噬菌体及治疗溶藻弧菌引起的水产养殖动物细菌病提供了噬菌体来源。
3.根据权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001，其特征在于，噬菌体RDP-VP-19001在pH为6-9范围内作用1小时，其效价在5.9×106pfu/mL之上，适合生长在中性环境中。
4.根据权利要求1所述的溶藻弧菌噬菌体RDP-VP-19001，其特征在于，噬菌体RDP-VP-19001在pH=12时，效价达到103pfu/mL，在pH=4时，仍有噬菌体存活，噬菌体的酸碱耐受范围宽。
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【专利技术属性】
技术研发人员：杜新永，李霞，江守杰，罗成盛，李先胜，赵丹丹，张庆，刘玉庆，盖春云，马如霞，刘爽，
申请(专利权)人：瑞科盟青岛生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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