猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法技术

本发明专利技术公开了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，其保藏编号为CCTCC NO：V 202020。据此，发明专利技术人构建了该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM并建立相应构建方法和插入基因的方法。该载体是以Gxnn1396‑P96为母本，通过分子生物学的手段，构建PRRSV全长感染性克隆载体，在cDNA克隆的基础上，在ORF4和ORF5a中插入一个独立的转录调控序列(TRS)，构建了一种表达绿色荧光蛋白(GFP)基因的PRRSV重组病毒。该荧光标记病毒的成功构建，为研制重组猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法
本专利技术属于猪繁殖与呼吸综合征病毒
，尤其涉及一株猪繁殖与呼吸综合征病毒及其克隆载体和插入基因方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)是威胁世界养猪业的重要传染病病原之一，引起的猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)为高度接触传染性疾病，主要引起母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等严重的繁殖障碍和仔猪呼吸障碍、生长停滞、高死亡率等临床表现。PRRSV给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。PRRSV是动脉炎病毒家族的成员，是一种单链RNA病毒，其基因组长度约为15.4kb，包括至少由九个开放阅读框编码的病毒的复制酶多蛋白和八个结构蛋白。PRRSV基因组的5′端约2/3区域编码两种多聚蛋白(pp1a和pp1ab)，经病毒蛋白酶处理后形成成熟的非结构蛋白(nsps)，Nsps在病毒复制和转录中起关键作用。PRR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏编号为CCTCC NO：V 202020，分类命名为porcine reproductive and respiratory syndrome virus Gxnn1396-P96。/n

【技术特征摘要】
1.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒，保藏编号为CCTCCNO：V202020，分类命名为porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusGxnn1396-P96。


2.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，其特征在于为该病毒基因组全长感染性克隆pGXAM。


3.根据权利要求2所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体，其特征在于该克隆载体中Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生一个沉默突变C-G突变，形成了MluⅠ酶切位点。


4.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的克隆载体在制备重组病毒或基因工程疫苗方面的应用。


5.权利要求3所述克隆载体的构建方法，其特征在于：从Gxnn1396-P96病毒感染的细胞培养物中提取病毒RNA，通过反转录获得第一链cDNA；以第一链cDNA为模板，用4对引物扩增出4个覆盖全基因组的cDNA片段，克隆到ZeroTOPO载体中，得到4个克隆质粒，分别命名为PRRSV-A、PRRSV-B、PRRSV-C和PRRSV-D；用限制性内切酶酶切四个克隆质粒，纯化回收目的片段，逐步替换到具有同样酶切位点的质粒pJX143中；用JX14402MluⅠF和PR15300引物在Gxnn1396-P96基因组14402核苷酸处产生了一个沉默突变C-G突变，所得片段经MluI和NotI酶切后连接到类似的酶切质粒pJX143中，得到Gxnn1396-P96株PRRSV的全长cDNA克隆pGXAM。


6.应用权利要求1所述克隆载体插入基因的方法，其特征在于：以ORF4和ORF5a之间作为外源基因插入位点，插入一种或者多种基因。


7.根据权利要求6所述的插入基因的方法，其特征在于：用序列表SEQ.NO.ID.10-14所示序列作为引物进行PCR扩增，在ORF4和ORF5...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦祖樟，王玉旭，贺微，李清清，谢欣，覃念，王豪，林思远，黄加滨，陈樱，欧阳康，黄伟坚，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45