一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种伪狂犬病毒弱毒株，为伪狂犬病病毒TK缺失株，是将猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因制备的；所述的伪狂犬病病毒QD株的保藏编号为CGMCC No.10266。本发明专利技术又提供了所述的伪狂犬病病毒弱毒株在制备伪狂犬疫苗中的应用。本发明专利技术伪狂犬病毒弱毒株是由保存的伪狂犬病病毒株经过TK基因缺失处理获得，于其往前构建方法相比，采用brdU压力与EGFP荧光标记双重筛选，缩短了重组伪狂犬病毒病病毒纯化代次和纯化时间，重组伪狂犬病病毒其致病力低，免疫原性强，用改伪狂犬病病毒弱毒株制备的弱毒活疫苗可以对小鼠和猪只等伪狂犬病病毒易感动物提供有效免疫保护。

【技术实现步骤摘要】
一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用
本专利技术属于疫苗制备
，特别是涉及到一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用。
技术介绍
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种急性传染病，该病的临床症状表现为哺乳期仔猪出现呕吐、昏睡、麻痹等神经症状，直至最后衰竭死亡，死亡率几乎为100％；而妊娠母猪感染后会出现流产、死胎及木乃伊胎等症状；育肥猪感染后出现呼吸道疾病症状；公猪感染后出现睾丸肿胀、萎缩及精液质量下降等症状；成年猪只多为隐性感染，耐过后会造成长期排毒的现象，成为危险的传染源。猪伪狂犬病因以上特点成为危害全球养猪业的重大传染病之一，已经给全世界养猪业带来巨大的经济损失。目前，很多欧洲国家宣布通过接种疫苗并结合血清学诊断技术净化猪伪狂犬病。我国自从2011年来，伪狂犬病又有卷土重来之势。研究显示伪狂犬病毒PRV是一种病毒粒子为圆形、直径为150-180nm、基因组为双链DNA、长度大小约为145kb的带有囊膜的疱疹病毒(Herpesviridae)。PRV由长度特区(UL区域)、短独特区(US区域)、内部倒转重复序列(IRs区域)、US区段两侧末端重复序列(TRs区域)四个部分组成。其核衣壳主要由UL19基因、UL35基因编码蛋白构成，核衣壳与囊膜之间存在被膜蛋白，至少有14种蛋白来自病毒基因组编码。PRV毒力收到多种基因的联合控制，其中有UL区的UL10、UL13、UL21、UL23(TK)、UL39/40、UL44、UL50，US区的US3、US7、US8。伪狂犬病尚无有效的治疗药物，通过接种疫苗是预防和控制猪伪狂犬病最直接有效的方法。现在应用较为广泛的是伪狂犬经典毒株Bartha株和BUK株所制备的疫苗。BarthaK61是由Bartha株在异源细胞反复传代所得，BUK则是将弱毒株Bucharest株通过鸡胚和鸡胚成纤维细胞连续传代约800代后获得的，上述两株对妊娠母猪和仔猪都有一定的免疫保护作用。基因缺失疫苗是一种通过基因工程技术去除与毒力相关的基因或者基因片段而获得的疫苗，其优点在于缺失位点明确稳定，不容易发生毒力反强，缺失后毒力降低但不影响免疫原性，但目前在伪狂犬病的防治和控制还缺少有效的基因缺失疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种伪狂犬病毒弱毒株及其应用，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种伪狂犬病毒弱毒株，为伪狂犬病病毒TK缺失株，是将猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因制备的；所述的伪狂犬病病毒QD株，为疱疹病毒Ⅰ型(PorcineherpesvirustypeI)伪狂犬病病毒QD株，于2015年3月6日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.10266。本专利技术又提供了所述的伪狂犬病病毒弱毒株在制备伪狂犬疫苗中的应用。所述伪狂犬病疫苗接种的对象为猪伪狂犬病毒易感动物。所述的伪狂犬病毒易感动物为小鼠和猪。本专利技术伪狂犬病毒弱毒株是由保存的伪狂犬病病毒株经过TK基因缺失处理获得，于其往前构建方法相比，采用brdU压力与EGFP荧光标记双重筛选，缩短了重组伪狂犬病毒病病毒纯化代次和纯化时间，重组伪狂犬病病毒其致病力低，免疫原性强，用改伪狂犬病病毒弱毒株制备的弱毒活疫苗可以对小鼠和猪只等伪狂犬病病毒易感动物提供有效免疫保护。具体实施方式本专利技术所使用的材料记载如下：PCDNA3.1-EGFP、pBluescript质粒均为本实验室保存；病毒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购买于Omega公司；primeSTAR聚合酶、2×GCbuffer、dNTPmix、5000bpmaker、pMD18-Tkit、BluntingKinationLigation均购买于宝生物工程有限公司；胎牛血清购买于金源康有限公司；DMEM培养基购买于生工生物工程股份有限公司；brdU购买于北京索莱宝公司；低熔点琼脂粉购买于sigma公司；DH5a感受态、ClonExpressUltraOneStepCloningKit购买于南京诺唯赞生物科技有限公司，磷酸钙转染试剂盒购买于Invitrogen公司。小鼠购买于济南朋悦实验动物中心；猪购买于济南金丰实验动物有限公司。但本领域的普通技术人员在本专利技术的技术思路下，可以选择本领域的其它常规试剂材料来进行替换。其中TK基因位于伪狂犬病毒PRV的UL23区，全长963bp，编码320个氨基酸，其主要功能是催化脱氧胸苷或嘧啶磷酸化为dTTP，参与核苷酸的合成途径以维持并促进病毒的复制。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：猪伪狂犬病病毒株TK基因扩增与克隆将于PK-15细胞繁殖的伪狂犬病病毒回收，经过反复冻融3次后，使用病毒DNA提取试剂盒提取PRV基因组，以PRV基因组为模板进行PCR扩增，体系为50μL体系，2×GCbuffer25μL，dNTPmix4μL，primeSTAR酶0.5μL，模板1μL，上下游引物各1μL，最后水补齐至50μL。PCR反应程序为98℃预变性2min，98℃变性1min，55℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环。PCR产物用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶纯化所需目的条带，使用Omega公司胶回收试剂盒进行回收，具体过程如下：在PCR产物中加入等体积的Bindingbuffer于2mLEP管中，60℃下融化胶条，孵育7min，每2分钟颠倒混匀溶液一次，保证胶条溶解充分。将溶解好的上述溶液加入试剂盒的HibindDNAColumms中，不要超过700uL的体积，在10000g/min1min的条件下离心，弃去收集管中溶液。再次加入300μLbindingbuffer后离心。加入SPWbuffer700μL在10000g/min1min的条件下离心，重复2次此操作。之后13000g/min2min的条件下空离，弃去收集管，将HibindDNAColumms至于自备1.5mLEP管中，加入30uLElutionbuffer，室温静置2min后，13000g/min1min离心收集PCR产物。取回收的PCR产物0.2—20pmol，加入2μL10×BluntingKinationbuffer，1μLBluntingKinationEnzymeMix，用水补齐至20μL体系，37℃反应10min，70℃热处理5min。之后取上述反应液5μL到新的微量离心管中，加入1μL已经去磷酸化处理的平末端载体DNA(50ng/μL—100ng/μL)混匀。再加入6μL的LigationsolutionI，混合。16℃反应一小时。将上述全量反应液转化至DH5a大肠杆菌感受态，之后涂布于氨苄抗性的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。待生长至合适大小时，挑取单个菌落，经PCR鉴定菌液为阳性后，提取质粒编号TKLR-T送至生工生物工程公司测序。根据测序结果序列，设计扩增TK基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述的伪狂犬病病毒弱毒株是将猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因制备的；所述的伪狂犬病病毒QD株的保藏编号为CGMCC No.10266。/n

【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述的伪狂犬病病毒弱毒株是将猪伪狂犬病病毒QD株缺失TK基因制备的；所述的伪狂犬病病毒QD株的保藏编号为CGMCCNo.10266。


2.权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株在制备疫苗中的应用。


3.一种疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：单学强，只勇，于泽坤，栾志舫，张伦，李思菲，郝光恩，杨海明，杨彦超，张敏，马广斌，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37