鸡滑液囊支原体检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提出鸡滑液囊支原体检测试剂盒及检测方法

【技术实现步骤摘要】
鸡滑液囊支原体检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于微生物检测
，尤其涉及鸡滑液囊支原体检测试剂盒及检测方法
。

技术介绍

[0002]鸡滑液囊支原体病是一种急性或慢性传染病，本病的病原为滑液囊支原体
(MS)
，是一种介于细菌和病毒之间的微生物，多日龄和多品种的鸡皆可感染，许多鸡群长期处于隐性带毒状态
。
由于该病发展时间长，通常当鸡在进入青年期和产蛋期后才表现症状，所以早期难以针对性防控，一旦发病对生长发育会造成不可逆的影响
。
发生该病的鸡群死亡淘汰率显著上升，造成青年鸡体重不达标，肉鸡生长发育缓慢，个体间均匀度下降；蛋鸡进入产蛋期后表现产蛋率下降，蛋壳质量差，产蛋高峰期维持时间短；致使病鸡跗关节
、
脚垫肿胀，造成滑液囊
、
肌腱发炎与呼吸道疾病等
。
本病传播范围广
、
速度快
、
病程长，一旦在鸡群中出现阳性感染鸡则很难根除，严重影响养鸡场户的经济效益
。
自
2010
年，南方的三黄鸡出现严重的滑液囊支原体感染后，
2013
年后北方也出现大面积感染报道，之后
2013
～
2021
年期间，几乎所有的养鸡省份和地区都有该病的发生，已经成为影响我国养鸡业发展的重要疫病之一
。
[0003]目前检测
MS
的方法包括：支原体的分离培养技术
>、
血清学检测技术及分子生物学检测技术
。
但是现有的检测方法均存在缺陷，例如，分离培养是诊断支原体感染性疾病的金标准，但支原体对培养基的营养要求高，生长缓慢，分离难度大，只适用于实验室检测；血清学检测技术如平板凝集试验
(SPA)
特异性低，与鸡毒支原体
(MG)
存在交叉抗原反应，容易出现假阳性；血凝抑制试验
(HI)
不适用于
MS
感染前期的检测，判读结果也比较复杂，并且还没有成熟的商业化试剂盒；聚合酶链反应
(PCR)
和实时荧光定量
PCR(real
‑
time PCR)
存在操作步骤多，成本高，耗时长的问题，不易现场进行操作和向基层推广；环介导等温扩增技术
(LAMP)
操作相对简单，检测快速，但只能进行定性分析而无法进行定量，试剂成本偏高，有时会出现假阴性
。
因此，研制特异
、
灵敏
、
廉价
、
简便的试剂盒是我国当前防控该病的迫切要求
。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对上述技术问题，提出鸡滑液囊支原体检测试剂盒及检测方法
。
该试剂盒采用
ELISA
检测技术为鸡滑液囊支原体的诊断及免疫后抗体水平的检测提供有效的检测方法，具有特异性强
、
灵敏度高和可重复性高的优点，能为鸡滑液囊支原体病的预防研究起到显著的促进作用
。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]本专利技术第一方面公开了一种鸡滑液囊支原体检测试剂盒，为
ELISA
试剂盒，以重组
MSPB
蛋白为包被抗原
。
[0007]作为优选，所述重组
MSPB
蛋白的制备方法包括以下步骤：以人工合成的鸡滑液囊
支原体
MSPB
蛋白的基因序列为模板扩增得到
SEQ ID No.1
所示的序列
(
如序列表所示
)
，将上述基因与原核表达载体
PET
‑
30a(+)
连接后获得重组表达载体；将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞
DH5
α
，扩大培养后再提取重组质粒，经
PCR
和酶切鉴定，筛选出阳性克隆
PET
‑
30a
‑
MSPB
；将上述重组质粒转化至
BL21(DE3)
感受态细胞并诱导表达后，通过
SDS
‑
PAGE
电泳分析蛋白表达情况，再采取
Ni
柱亲和层析法，对目的蛋白进行纯化，最后分别通过
SDS
‑
PAGE
和
Western blot
检测蛋白纯化结果，并分析
MSPB
蛋白的抗原性
。
[0008]作为优选，所述重组
MSPB
蛋白的制备方法包括以下步骤：
[0009]1)
扩增目的基因：以人工合成的鸡滑液囊支原体
MSPB
蛋白基因序列为模板，通过
PCR
法对
MSPB
基因进行扩增
、
克隆得到目的基因，上游引物加
BamH I
酶切位点，下游引物加
Xhol I
酶切位点，引物如下：
[0010]MSPB
基因上游引物：5’‑
TACTTTTTATTTTTTTAATTTAATGA
‑3’
[0011]MSPB
基因下游引物：5’‑
ATGATATTTCGACTACGACCAGCATGT
‑3’
[0012]2)
提取阳性重组表达质粒：
PET
‑
30a(+)
质粒提取后用
BamH I、Xhol I
进行双酶切，回收目的片段，与回收的
MSPB
基因在
T4DNA
连接酶作用下，将载体和目的基因按摩尔比
1:5
的比例在
16℃
的温度条件下连接
12
～
16
小时，转化感受态细胞
DH5
α
，提取质粒，经
BamH I、Xhol
酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒
PET
‑
30a
‑
MSPB
；
[0013]3)
电泳分析：将提取质粒
PET
‑
30a
‑
MSPB
转化
BL21(DE3)
感受态细胞，获得的阳性质粒菌于
37℃
培养，待
OD
600
值达到
0.6
～
0.8
时，加入终浓度为
1mmol/L
的
IPTG
进行诱导表达，收集诱导表达后4小时的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清及沉淀进行
SDS
‑
PAGE
电本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种鸡滑液囊支原体检测试剂盒，其特征在于，为
ELISA
试剂盒，以重组
MSPB
蛋白为包被抗原
。2.
根据权利要求1所述的鸡滑液囊支原体检测试剂盒，其特征在于，所述重组
MSPB
蛋白的制备方法包括以下步骤：以人工合成的鸡滑液囊支原体
MSPB
蛋白的基因序列为模板扩增得到
SEQ ID No.1
所示的序列，将上述基因与原核表达载体
PET
‑
30a(+)
连接后获得重组表达载体；将重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞
DH5
α
，扩大培养后再提取重组质粒，经
PCR
和酶切鉴定，筛选出阳性克隆
PET
‑
30a
‑
MSPB
；将上述重组质粒转化至
BL21(DE3)
感受态细胞并诱导表达后，通过
SDS
‑
PAGE
电泳分析蛋白表达情况，再采取
Ni
柱亲和层析法，对目的蛋白进行纯化，最后分别通过
SDS
‑
PAGE
和
Western blot
检测蛋白纯化结果，并分析
MSPB
蛋白的抗原性
。3.
根据权利要求2所述的鸡滑液囊支原体检测试剂盒，其特征在于，所述重组
MSPB
蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)
扩增目的基因：以人工合成的鸡滑液囊支原体
MSPB
蛋白基因序列为模板，通过
PCR
法对
MSPB
基因进行扩增
、
克隆得到目的基因，上游引物加
BamH I
酶切位点，下游引物加
Xhol I
酶切位点，引物如下：
MSPB
基因上游引物：5’‑
TACTTTTTATTTTTTTAATTTAATGA
‑3’
MSPB
基因下游引物：5’‑
ATGATATTTCGACTACGACCAGCATGT
‑3’
2)
提取阳性重组表达质粒：
PET
‑
30a(+)
质粒提取后用
BamH I、Xhol I
进行双酶切，回收目的片段，与回收的
MSPB
基因在
T4DNA
连接酶作用下，将载体和目的基因按摩尔比
1:5
的比例在
16℃
的温度条件下连接
12
‑
16
小时，转化感受态细胞
DH5
α
，提取质粒，经
BamH I、Xhol
酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒
PET
‑
30a
‑
MSPB
；
3)
电泳分析：将提取质粒
PET
‑
30a
‑
MSPB
转化
BL21(DE3)
感受态细胞，获得的阳性质粒菌于
37℃
培养，待
OD
600
值达到
0.6
～
0.8
时，加入终浓度为
1mmol/L
的
IPTG
进行诱导表达，收集诱导表达后4小时的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清及沉淀进行
SDS
‑
PAGE
电泳分析；
4)
蛋白纯化：使用
Ni
‑
NTA
进行亲和层析纯化，纯化后的目的蛋白进行
SDS
‑
PAGE
分析，结果表明
1mmol/L
的
IPTG
诱导
4h
，基因工程菌获得高效的表达，产生约
47KDa
的特异性蛋白条带，与预测的分子质量相符；
5)Western blot
分析切胶回收蛋白的抗原性
。4.
根据权利要求1所述的鸡滑液囊支原体检测试剂盒，其特征在于，其
ELISA
板的包被方法为：用包被液将所述重组
MSPB
蛋白稀释为2μ
g/mL
，按
100
μ
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋红彬，马广斌，王方山，赵永伟，邢杰，梁雨欣，苗昱，李焕明，宋美莹，宋金栋，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：