寨卡病毒ZG01株反向遗传系统的构建及其应用技术方案

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属，近年来其亚洲谱系病毒由南美等地开始扩散至全球多个国家。ZIKV感染与格林‑巴利综合征和一些出生缺陷，包括小头症等有关联。反向遗传系统是研究病毒生命周期、发病机制、疫苗研发和抗病毒药物的重要工具，但是黄病毒基因组的cDNA克隆在转化细菌内的毒性和不稳定性一直是阻碍构建感染性克隆的一大技术难点。本发明专利技术构建了一个遗传稳定的真核启动的ZIKV的全长感染性克隆ZG01。ZG01反向遗传系统为研究ZIKV生活周期、ZIKV‑宿主相互作用、疫苗和抗病毒药物研发提供一个平台和研究工具。我们的构建方法还可为其他黄病毒或者RNA病毒的反向遗传学系统的构建和研究提供科学参考。

【技术实现步骤摘要】
寨卡病毒ZG01株反向遗传系统的构建及其应用
本专利技术属于病毒分子生物学和基因克隆
，具体涉及一种寨卡病毒ZG01毒株的构建及其应用。
技术介绍
寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)属于黄病毒科黄病毒属，近年来其亚洲谱系病毒由南美等地开始扩散至全球多个国家。ZIKV感染与格林-巴利综合征和一些出生缺陷，包括小头症等有关联。反向遗传系统是研究病毒生命周期、发病机制、疫苗研发和抗病毒药物的重要工具，但是黄病毒基因组的cDNA克隆在转化细菌内的毒性和不稳定性一直是阻碍构建感染性克隆的一大技术难点。ZIKV的反向遗传系统方面，2016年6月，Shan等人率先报道了一个基于FSS13025毒株的全长感染性cDNA克隆构建，这也是目前唯一一例ZIKV全基因组组装在低拷贝载体并在大肠杆菌体内直接复制扩增的案例。Tsetsarkin等人(2016年)构建了基于2015年从巴西一名患者体内分离得到的Paraiba_01/2015毒株的感染性克隆，但相对于原始病毒，这一克隆在多种细胞系内减毒，在一定程度上限制了它们对研究的效用。ZIKV亚洲谱系毒株之间的差异尚不清楚，因此每一株病毒的感染性克隆对于研究病毒的扩散都是很重要的。缺乏具有类似于野生型病毒的表型性质的感染性克隆系统仍然是研究当前流行的病毒株的传播、发病机理和免疫应答机制的障碍。Schwarz等和Gadea等人发表的感染性克隆都是基于MR766毒株，前者通过在NS1蛋白中插入真核内含子构建克隆，后者则通过ISA(Infectioussubgenomicamplicons)方法实现ZIKV感染性克隆的快速组装，同时他们尝试在核心蛋白中间插入GFP基因序列，构建出可以表达GFP报告基因的重组ZIKV。Weger-Lucarelli等(2015年)报道了从波多黎各分离的的ZIKVPRVABC59毒株的反向遗传学系统，他们构建了一个双质粒感染克隆系统，其表达的ZIKV可以与野生型病毒达到相近的复制效率，重组病毒在埃及伊蚊中表现出与野生型相当的传播率，并在AG129小鼠中显示出类似的发病机制。Widman等(2017年)报道了一系列ZIKV反向遗传系统，包含了从MR766和H/PF/2013，到SPH2015和BeH819015等巴西本地流行株，这些克隆是利用四段基因组序列通过IIG型酶切形成的回文结构的定向连接来完成的。Liu等人(2017年)首次报道了一个基于中国境内ZIKV毒株GZ01的感染性克隆，构建过程中他们在E蛋白和NS1蛋白连接处附近插入真核内含子稳定质粒，这一内含子需要在体外转录后通过体外RNA自我剪接步骤去除。虽然近几年已经有多个研究团队报道了ZIKV全长cDNA感染性克隆的构建，但多数是基于2015年ZIKV爆发性传播之前所分离的毒株，例如MR766，FSS13025和H/PF/2013等。针对黄病毒基因组在细菌宿主中的毒性和不稳定性，多质粒系统的体外重组和在基因组中插入真核内含子等方法被应用其中，但这些方法在实际操作上非常复杂且耗时长。所以开发一个优质高效ZIKV实验模型一直是亟需改善和解决的问题。
技术实现思路
基于此，本专利技术构建了一个遗传稳定的真核启动的ZIKV的全长感染性克隆ZG01。ZG01反向遗传系统为研究ZIKV生活周期、ZIKV-宿主相互作用、疫苗和抗病毒药物研发提供一个平台和研究工具。我们的构建方法还可为其他黄病毒或者RNA病毒的反向遗传学系统的构建和研究提供科学参考。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：1、从患者尿液标本中提取ZIKVZG01毒株。2、通过PCR扩增了覆盖整个病毒基因组的三个片段，然后组装到pBR322来源的低拷贝载体pTight。基因组5’端有CMV启动子，3’端有HDVr，这两个元件分别用于在真核细胞中启动DNA转录以及通过自切割活性去除非病毒序列。pTight载体含有七次四环素应答元件以减少黄病毒基因组对感受态细胞的毒性。片段A由于不能直接被组装进入载体，我们将其分为A1和A2两段，并在A2片段的E蛋白中引入ECP(E.colipromoter大肠杆菌启动子)沉默突变，构建了ZIKVZG01的全长克隆(图1)3、利用适应性突变获得高效稳定的感染性克隆，从患者尿液中提取到的ZIKV病毒接种到新生鼠脑，7-12天后从新生鼠脑中获得含有病毒的组织悬液接种到Vero细胞，传代后得到到107.5PFU/ml的高滴度ZIKV，以此为模板进行逆转录，用PCR合成覆盖ZIKV的ORF及大部分UTR的片段，并进行测序，用PCR合成覆盖ZIKV的ORF及大部分UTR的片段，并进行测序。将测序结果与初始ZG01序列进行比对后，我们鉴定出了四个核苷酸突变(C2178T/G2913A/T4991C/T10561C)(表1)，将所有的四个突变同时加入到全长cDNA克隆ZG01中，命名为ZG01_4m。将ZG01_4m对Vero细胞进行转染，在转染中，ZG01_4m显示出高效的病毒复制和较高的感染率。转染得到的重组病毒ZG01_4m。在Vero细胞中传代两次得到二代病毒，提取病毒上清RNA并进行测序，所加入的突变稳定存在，未发现新的突变，表明ZG01_4m重组病毒可以在细胞中传代后保持遗传稳定。4、将重组的ZG01_4m病毒在vero细胞中的复制曲线和亲代病毒在细胞上和新生鼠脑部的复制曲线进行比较，发现重组病毒在体外感染细胞系后，病毒的复制效率与亲代病毒相当。(图2图3)5、将质粒用Turbo感受态细胞进行转化，挑取4-5个单克隆，在液体培养基中混合培养，然后提取质粒，并重复此步骤五次，得到第五代pZG01_4m质粒，命名为pZG01_4m-G5，将其进行DNA测序，其序列与未经在细菌内多次扩增的pZG01_4m完全一致，表明ZG01_4m克隆在Turbo细菌中有很高的遗传稳定性(图4)。附图说明图1是构建ZIKV全长感染性克隆的图示。ZIKV病毒株ZG01基因组、限制性内切酶位点的核苷酸位置及克隆步骤。首先合成覆盖整个ZIKV病毒基因组的三个PCR片段，A、B和C，然后组装到pBR322来源的低拷贝载体pTight。基因组5’端有CMV启动子，3’端有HDVr，这两个元件分别用于在真核细胞中启动DNA转录以及通过自切割活性去除非病毒序列。pTight载体含有七次四环素应答元件以减少黄病毒基因组对感受态细胞的毒性。片段A由于不能直接被组装进入载体，我们将其分为A1和A2两段，并在A2片段的E蛋白中引入ECP(E.colipromoter大肠杆菌启动子)沉默突变。图中核苷酸位置参考ZIKVZG01株，GenBankID：KY379148。图2是经多次传代高滴度ZG01基因中的适应性突变。(A)ZG01株基因组，含ECP1突变和四个从体内体外传代中发现的适应性突变。(B-E)单个适应性突变或突变组合提高了pZG01转染后的病毒产量。将感染性克隆质粒转染进Vero细胞中，在如图所示时间点收集细胞培养上清液，用空斑实验测定上清液中的感染性滴度。进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寨卡病毒毒株ZIKV ZG01，其特征在于，所述的核苷酸全长序列为GenBank ID：KY379148。/n

【技术特征摘要】
1.一种寨卡病毒毒株ZIKVZG01，其特征在于，所述的核苷酸全长序列为GenBankID：KY379148。


2.如权利要求1所述的毒株ZIKVZG01，其特征在于，增加四个突变(C2178T/G2913A/T4991C/T10561C)，构建了带四个突变且能够稳定遗传的高效全长感染性克隆ZG01_4m。


3.如权利要求1所述的毒株ZIKVZG01，其特征在于，单独突变ECP1获得了含有ZG01全长克隆的转化子，含有ECP1突变的ZG01全长克隆pZG01(见图1)。


4.如权利要求2所述的高效全长感染性克隆ZG01_4m，转染Vero细胞可以复制，获得高效感染性的病毒。


5.权利要求1所述的寨卡...

【专利技术属性】
技术研发人员：李义平，陈奕奕，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44