一种用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片及其制备和应用，其特征在于：蛋白质芯片用于人血清中EB病毒衣壳抗原IgM抗体、衣壳抗原IgG抗体和核抗原1蛋白IgG抗体的联合检测；所述蛋白质芯片是在固相载体表面点阵固定有EB病毒衣壳抗原探针和EB病毒核抗原1蛋白探针；所述固相载体为S‑S‑PEG‑COOH化学修饰的金箔芯片，在所述S‑S‑PEG‑COOH上用EDC和NHS活化羧基以固定特异性抗原为探针。本发明专利技术的芯片具有高特异性和敏感性，其可视检测限与CLIA法测得EB病毒抗体的最低检测限近乎相同，且其可以实现高通量联合检测。

Protein chip used for joint detection of EB virus capsid antigen and nuclear antigen 1 protein antibody and preparation and application thereof

The invention discloses a method for EB virus capsid antigen and nuclear antigen 1 combined detection of antibody protein chip and its preparation and application, which is characterized in that the protein chip for detection of human EB virus capsid antigen in serum IgM antibody, IgG antibody and antigen capsid protein 1 IgG nuclear antigen antibody; the protein chip on the surface of a solid phase carrier lattice is fixed with EB virus capsid antigen probe and EB virus nuclear antigen 1 protein probe; the solid support for gold chip S S PEG COOH chemical modification, in the S S PEG COOH with EDC and NHS activation of the carboxyl group to fix specific antigen as a probe. The chip of the invention has high specificity and sensitivity, and its visual detection limit is almost the same as that of the CLIA method for measuring the minimum detection limit of the EB virus antibody, and it can realize high throughput combined detection.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于爱泼斯坦一巴尔病毒(Epstein一Barrvirus，简称EB病毒)衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片，属于生物

技术介绍
EB病毒是一种普遍存在的人类γ疱疹病毒，主要通过唾液传播感染人的上皮细胞和B细胞，与许多疾病的发生都有着密切的关系，威胁着人类的健康。EB病毒是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体，30–70％在青春期获得的原发感染会发展为IM。而EB病毒潜伏性感染则存在于90％以上的世界人口，与多种恶性肿瘤的病因相关，包括鼻咽癌(NPC)、淋巴恶性肿瘤、移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)、系统性红斑狼疮(SLE)和胃癌(GC)等。EB病毒相关肿瘤的发病率约每年200000例，是一种广泛有用的肿瘤标志物。目前EB病毒的检测，临床上常用Real-timePCR检测病毒载量(VL)、ELISA/IIF分析血清学抗体来反映病毒感染阶段和发展风险，但存在病毒载量没有标准临界值和ELISA/IIF检测灵敏度较低的缺陷。间接化学发光法(CLIA)是广泛使用的自动化EB病毒血清学检测平台，敏感性高于ELISA，但特异性稍差。ELISA和CLIA每次一般只能对一种抗体进行分析，而单个指标对感染状态不足以进行有效诊断。对多种抗体进行检测时，工作量也会增大。因而，研发一种简单易行的、以高特异性和敏感性为目标的新型生物芯片进行集成检测，将很有意义。血清学检测是常用的诊断工具，可以检测EB病毒感染的不同阶段。病毒衣壳抗原(VCA)具有很强的免疫原性，最初感染EBV的患者血清中可检测到VCA-IgM抗体，是EB病毒近期感染的标志，对于免疫活性人群来说是诊断IM的最重要方法。VCA-IgG抗体随后出现。EBV核抗原1蛋白(EB病毒EBNA-1)是唯一一个在所有EB病毒相关肿瘤细胞中都表达的病毒蛋白，其IgG阳性结果可以排除急性EB病毒感染，是既往感染的标记。本专利技术的检测指标是基于共识的EBV抗体谱：原发感染以VCAIgM抗体阳性和EBNA-1IgG抗体阴性为特征，而既往感染的以VCAIgM抗体阴性和VCAIgG、EBNA-1IgG抗体阳性为特征。联合检测可进一步提高其检测性能，且联合检测方便省时,有利于检测芯片的应用推广。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白联合抗体检测的蛋白质芯片及其制备方法和使用方法，以用于人血清中EB病毒衣壳抗原IgM抗体、衣壳抗原IgG抗体和核抗原1蛋白IgG抗体的联合检测。本专利技术的另一个目的在于提供一种基于上述蛋白质芯片的蛋白质芯片试剂盒。本专利技术解决技术问题采用如下技术方案：一、本专利技术首先公开了一种用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白联合抗体检测的蛋白质芯片，其特点在于：所述蛋白质芯片用于人血清中EB病毒衣壳抗原IgM抗体、衣壳抗原IgG抗体和核抗原1蛋白IgG抗体的联合检测；所述蛋白质芯片是在固相载体表面点阵固定有EB病毒衣壳抗原探针和EB病毒核抗原1蛋白探针；所述固相载体为S-S-PEG-COOH化学修饰的金箔芯片，在所述S-S-PEG-COOH上用EDC和NHS活化羧基以固定特异性抗原为探针。二、本专利技术同时公开了上述蛋白质芯片的制备方法，包括如下步骤：步骤1：对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体以浓度为2mM的DT2的乙醇溶液为修饰液1；将NHS和EDS溶于0.1M的MES缓冲液中作为修饰液2，在所述修饰液2中NHS浓度为50mM、EDC浓度为200mM；对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育3小时，S-S-PEG-COOH通过Au-S键组装到金芯片，二硫键使结合稳定性更好；取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；DT2修饰的芯片可保存数月。固化探针前，再以所述修饰液2点样孵育0.5小时活化(活化的羧基可通过酰胺反应稳定结合蛋白质探针)，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体待用；步骤2：固定EB病毒抗原探针将衣壳抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于50μg/mL的衣壳抗原溶液；将核抗原1蛋白溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于6.25μg/mL的核抗原1蛋白溶液；将所述衣壳抗原溶液点样孵育于固相载体的奇数行，将核抗原1蛋白溶液点样孵育于固相载体的偶数行，室温孵育2h，使固相载体的奇数行包被EB病毒衣壳抗原探针、偶数行包被EB病毒核抗原1蛋白探针；取出后将芯片浸没在1M乙醇胺中15分钟，以封闭剩余的已活化羧基，进一步有效避免实验的非特异性吸附；最后再用PBST溶液清洗、氮气吹干，即获得用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白联合检测的的蛋白质芯片。其中：步骤1对金箔芯片进行清洗的方法为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗，再用无水乙醇清洗，最后用氮气吹干。三、本专利技术还进一步公开了上述蛋白质芯片的使用方法，具体为：将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度2.5μg/mL的IgG荧光二抗溶液；将Cy5标记羊抗人IgM抗体和Cy3标记驴抗人IgG抗体共同溶于PBST-BSA溶液中，构成浓度各为2.5μg/mL的IgM+IgG荧光二抗溶液；将待检测患者血清稀释10～80倍，然后分别点样于所述蛋白质芯片任意一个奇数行的EB病毒衣壳抗原探针和一个偶数行的EB病毒核抗原1蛋白探针上，常温条件下孵育抗体1小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干；将所述IgM+IgG荧光二抗溶液和所述IgG荧光二抗溶液分别点样于孵育有抗体的EB病毒衣壳抗原探针和EB病毒核抗原1蛋白探针之上，室温孵育1小时，然后用PBST溶液清洗、氮气吹干；若EB病毒衣壳抗原探针处呈现荧光色，则待测患者血清中含有衣壳抗原IgM抗体和/或衣壳抗原IgG抗体，若EB病毒衣壳抗原探针处无荧光色，则待测患者血清中不含有衣壳抗原IgM抗体和衣壳抗原IgG抗体；若EB病毒核抗原1蛋白探针处呈现荧光色，则待测患者血清中含有核抗原1蛋白IgG抗体，若EB病毒核抗原1蛋白探针处无荧光色，则待测患者血清中不含有核抗原1蛋白IgG抗体；在使用时，还应同时将抗原抗体全阴性的健康人血清同时点样于同一蛋白质芯片的其他抗原探针上，作为阴性对照。四、本专利技术还进一步公开了一种用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白联合检测的试剂盒，其包含有：上述的蛋白质芯片；PBST-BSA溶液；将Cy3标记驴抗人IgG抗体溶于PBST-BSA溶液中，构成的浓度2.5μg/mL的IgG荧光二抗溶液；将Cy5标记羊抗人IgM抗体和Cy3标记驴抗人IgG抗体共同溶于PBST-BSA溶液中，构成的浓度各为2.5μg/mL的IgM+IgG荧光二抗溶液。上述技术方案中：所述PBST溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween20混合配置而成的，在所述PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1％；所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS、Tween20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween20的体积浓度为0.1％，胎牛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片，其特征在于：所述蛋白质芯片用于人血清中EB病毒衣壳抗原IgM抗体、衣壳抗原IgG抗体和核抗原1蛋白IgG抗体的联合检测；所述蛋白质芯片是在固相载体表面点阵固定有EB病毒衣壳抗原探针和EB病毒核抗原1蛋白探针；所述固相载体为S‑S‑PEG‑COOH化学修饰的金箔芯片，在所述S‑S‑PEG‑COOH上用EDC和NHS活化羧基以固定特异性抗原为探针。

【技术特征摘要】
1.一种用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片，其特征在于：所述蛋白质芯片用于人血清中EB病毒衣壳抗原IgM抗体、衣壳抗原IgG抗体和核抗原1蛋白IgG抗体的联合检测；所述蛋白质芯片是在固相载体表面点阵固定有EB病毒衣壳抗原探针和EB病毒核抗原1蛋白探针；所述固相载体为S-S-PEG-COOH化学修饰的金箔芯片，在所述S-S-PEG-COOH上用EDC和NHS活化羧基以固定特异性抗原为探针。2.一种权利要求1所述的用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白抗体联合检测的蛋白质芯片的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：步骤1、对金箔芯片进行表面化学修饰，获得固相载体以浓度为2mM的DT2的乙醇溶液为修饰液1；将NHS和EDC溶于0.1M的MES缓冲液中作为修饰液2，在所述修饰液2中NHS浓度为50mM、EDC浓度为200mM；对金箔芯片进行清洗后，浸入所述修饰液1中，黑暗条件下室温摇荡孵育3小时，取出后用无水乙醇溶液清洗、氮气吹干；然后再以所述修饰液2点样孵育0.5小时，取出后用PBST溶液清洗、氮气吹干，获得固相载体待用；所述PBST溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS与Tween20混合配置而成的，在所述PBST溶液中Tween20的体积浓度为0.1％；步骤2：固定EB病毒抗原探针将衣壳抗原溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于50μg/mL的衣壳抗原溶液；将核抗原1蛋白溶于PBST-BSA溶液中，配制浓度不低于6.25μg/mL的核抗原1蛋白溶液；将所述衣壳抗原溶液点样孵育于固相载体的奇数行，将核抗原1蛋白溶液点样孵育于固相载体的偶数行，室温孵育2h，使固相载体的奇数行包被EB病毒衣壳抗原探针、偶数行包被EB病毒核抗原1蛋白探针；取出后将芯片浸没在1M乙醇胺中15分钟，以封闭剩余的已活化羧基；最后再用PBST溶液清洗、氮气吹干，即获得用于EB病毒衣壳抗原和核抗原1蛋白联合检测的的蛋白质芯片；所述PBST-BSA溶液是由浓度0.01M、pH＝7.4的磷酸缓冲液PBS、Tween20及胎牛血清BSA混合构成，在所述PBST-BSA溶液中Tween20的体积浓度为0.1％，胎牛血清BSA的质量浓度为0.1％。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1对金箔芯片进行清洗的方法为：将NH3、H2O2及H2O按体积比1：1：5混合构成TL1清洗液，将金箔芯片浸入盛有TL1清洗液的不锈钢清洗盒内，82℃水浴6分钟，清洗2次，取出之后用超纯水冲洗，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜卫东，吕慧，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34