缺失调亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种缺失凋亡抑制基因病毒的构建及其应用。它是以腺病毒或单纯疱疹病毒为材料，经过ＰＣＲ扩增基因片段，插入质粒ＤＮＡ中，进一步用ＧＦＰ等标记基因和ＴＮＦ等效应基因，构建出转移载体，插入失活与复制有关的凋亡抑制基因，并与相应的野生型病毒共转染，筛选重组病毒，分别得到Ｅ１ｂ５５Ｋ基因缺失的重组腺病毒和ν↓［１］３４．５基因失活的重组单纯疱疹病毒。本发明专利技术的方法简单、快速、直观，所构建的重组病毒安全、稳定，有高度靶向性和选择性。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种缺失凋亡抑制基因病毒的构建以及所构建的重组病毒用于肿瘤的基因治疗，属于分子病毒学
，也属于医学
肿瘤是一种严重威胁人类健康的严重疾病。肿瘤的发生与防治研究过去是、现在是、并在未来一定时期内仍将是生命科学研究的热点。世界卫生组织(WHO)1997年5月3日在日内瓦发布世界健康状况报告，预测未来的25年间，世界大部分国家患肿瘤的病人数量可能大大增加。从现在到2005年，欧盟国家内，妇女肺癌患者将增加33％，男性前列腺癌患者将增加40％，全世界，特别是发展中国家，患其它种类肿瘤的人数也将迅速增加。各种肿瘤每年导致630万人死亡。在中国，肿瘤现在已成为仅次于心脑血管病的第二大致死病因，肿瘤严重威胁着人们的健康。研究肿瘤，治疗肿瘤，刻不容缓。现在对肿瘤的治疗首选手术切除，配合放、化疗。放、化疗都有诸如骨髓抑制(白、红细胞、血小板减少)、肝肾损害等严重副作用。中草药治疗癌症尚处于摸索阶段，机制不清楚，疗效不稳定，对提高机体免疫力有一定的帮助，但想选择性杀死瘤困难重重。许多病毒内既存在凋亡基因，又存在凋亡抑制基因，呈相对平衡状态，正是由于凋亡基因等的存在，病毒才导致细胞凋亡、机体受损。但凋亡抑制基因也是病毒复制所需要的，病毒这一绝对的细胞内寄生物，没有细胞则不能完成复制，就没有子代病毒释放出来去感染周围的细胞。从整体上来看，缺失凋亡抑制基因的病毒在正常细胞中不能复制，不会对机体造成严重危害，而肿瘤细胞呈无限增殖状态或“凋亡抑制”状态，它能支持缺失凋亡抑制基因的病毒的复制，因此这种病毒在肿瘤细胞内能选择性增殖，进而裂解杀死肿瘤细胞。已发现的病毒凋亡抑制基因有腺病毒(Adenovirs)的Elb、单纯疱疹病毒(HSV)的γ134.5、巨细胞病毒(HCMV)IE1、IE2、人乳头瘤病毒(HPV)E6等基因，从理论上讲缺失这些基因的病毒都可望用于肿瘤的生物治疗。1996年10月Science周刊报导了美国ONYX制药公司用缺失凋亡抑制基因ElB55K的腺病毒突变体治疗肿瘤的工作。缺失病毒在正常细胞中不复制，但能在癌细胞中复制并最终裂解杀灭癌细胞。将缺失病毒注入荷人宫颈癌的裸鼠瘤体内，发现所有肿瘤尺寸均显著减小，60％的实验肿瘤完全消退，。1997年11月，Science又报导了一期临床试验结果32例受试头颈癌患者中，12例肿瘤尺寸明显减小，减小幅度可达90％，未发现任何毒副作用。。但他们没有在EIB55K缺失腺病毒中插入治癌效应基因，没有对腺病毒进行改造使其成为通用的基因治疗载体。国内尚未见到开展此类工作的报导。为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于构建一种安全、稳定、有高度靶向性和选择性的、能在肿瘤细胞中复制并最终可以裂解杀伤肿瘤细胞的缺失凋亡抑制基因的重组病毒。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是本专利技术以腺病毒(AdV)或单纯疱疹病毒(HSV)为材料，经过PCR技术扩增基因片段，插入质粒DNA中，进一步用P53、TNF、Barnase、Reaper等效应基因和GFP、LacZ、Neor等标记基因，构建出转移载体，缺失或插入失活与复制有关的凋亡抑制基因，并与相应的野生型病毒共转染，筛选重组病毒，即可分别得到Elb55K基因缺失的重组腺病毒或γ134.5基因失活的重组单纯疱疹病毒。具体构建过程如下一.Elb55K基因缺失的重组腺病毒的构建1．从腺病毒DNA中PCR扩增E1区片段，插入质粒DNA中，得到腺病毒E1区克隆载体；2．在腺病毒E1区克隆载体中进一步用P53、TNF、Barnase、Reaper等效应基因和GFP、LacZ、Neor等标记基因，缺失Elb55K基因，并与野生型腺病毒共转染293细胞，筛选Elb55基因缺失的重组腺病毒。二．γ134.5基因失活的重组单纯疱疹病毒的构建1．从HSV DNA中PCR扩增γ134.5基因片段，插入质粒DNA中，得到HSVγ134.5基因克隆载体；2．在HSVγ134.5基因克隆载体中进一步用P53、TNF、Barnase、Reaper等效应基因和GFP、LacZ、Neor等标记基因，缺失或失活γ134.5基因，并与野生型HSV共转染哺乳动物细胞，筛选出γ134.5基因失活的重组病毒。通过上述构建所得的重组病毒可用于多种肿瘤的基因治疗，裂解杀灭肿瘤细胞，如神经母细胞瘤细胞、皮肤癌细胞、肺腺癌细胞及其它p53-肿瘤细胞等。与已有技术相比较，采用本专利技术的技术措施所取得有益效果本专利技术首次提出了缺失或失活的基因重组病毒作为肿瘤的基因治疗载体，所构建的Elb55K基因缺失的重组腺病毒和γ134.5基因失活的重组单纯疱疹病毒是基于病毒凋亡与复制、凋亡与肿瘤发生的关系，这种重组病毒能选择性地感染肿瘤细胞而在正常细胞中仅能发生流产感染，即可选择性地杀灭癌细胞而不杀死正常细胞，而且安全、稳定；这一方案开辟了一条构建AdV和HSV新型基因治疗载体和进行癌症基因治疗的新途径，因此，本专利技术的技术不仅在学术上有重要的学术价值，而且还具有重要的社会和经济效益。本专利技术在构建中插入了治癌效应基因和标记基因，从而大大增强了其治疗效应，简化了生产的筛选和监控过程，因此，本专利技术的构建方法还具有简单、快速、无毒、直观等特点。下面结合具体的实施例对本专利技术的技术措施作进一步的说明。实施例1缺失γ134.5基因带LacZ标记的重组单纯疱疹病毒(HSV)的构建1．用PCR技术从单纯疱疹病毒中扩增出γ134.5基因，插入质粒pGEM-32f的BamHⅠ位点，命名为pG34.5；2．用NotⅠ酶消化pG34.5，切去γ134.5基因中的700bp片段，回收剩余的大片段备用；3．用EcoRⅠ、BamHⅠ消化pSV-LacZ，回收LacZ表达盒，插入质粒pFast的EcoRⅠ、BamHⅠ位点，使LaeZ表达盒的上游带NotⅠ位点，新质粒命名为pFL。用XhoⅠ、BamHⅠ消化pFL，回收Xkol/BamHⅠ片段，插入质粒pBluescript的XhoⅠ、BamHⅠ位点，新质粒命名为pBL。pBL中的LacZ表达盒上、下游均带NotⅠ位点。用NotⅠ消化pBL，回收上、下游均带NotⅠ的LacZ表达盒；4．用T4 DNA连接酶，将2所得剩余大片段与3所得上、下游均带NotⅠ的LacZ表达盒连接起来，新质粒命名为pG34.5-LacZ+，此质粒带LacZ报导基因及HSVγ134.5基因的左翼、右翼序列，但去掉了HSVγ134.5基因中的700bp片段；5．pG34.5-LacZ+与野生型HSV共转染人神经母细胞瘤细胞，发生同源重组后，筛选带LacZ报导基因，在X-GaL存在时呈蓝色的重组病毒，即为缺失γ134.5基因带LacZ标记的重组单纯疱疹病毒。实施例2Elb55K基因失活的重组腺病毒的构建1．采用PCR技术从腺病毒DNA中扩增出E2片段，插入质粒pUC19的XhoⅠ位点，构建成转移载体，命名为pUEl；2．用EcoRⅠ,SalⅠ消化质粒pSV-LacZ，回收LacZ表达盒，插入质粒pBluescript的SalⅠ,EcoRⅠ位点，新质粒命名为pBlueLacZ；3．采用BamHⅠ位点消化pBlueLacZ，回收LacZ表达盒BamHⅠ大片段，插入pUCEl的Elb55K基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缺失凋亡抑制基因病毒的构建，其特征在于：它是以腺病毒或单纯疱疹病毒为材料，经过ＰＣＲ技术扩增基因片段，插入质粒ＤＮＡ中，进一步用标记基因和效应基因，构建出转移载体，缺失或插入失活与复制有关的凋亡抑制基因，并与相应的野生型病毒共转染，筛选重组病毒，即可分别得到Ｅ１ｂ５５Ｋ基因缺失的重组腺病毒和γ↓［１］３４．５基因失活的重组单纯疱疹病毒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：齐义鹏，肖庚富，齐兵，苏霏，王业富，刘德立，朱应，李晓锋，刘子夜，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]