一种微生物发酵生产提高L‑丙氨酸产量的补料控制方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物发酵生产提高L‑丙氨酸产量的补料控制方法，包括微量元素混合液补料以及pH在线监测以及葡萄糖补料。微量元素混合液的补料，避免了微量元素在培养基中消耗，后期得不到必要的补充的问题。通过本发明专利技术的补料方法，可以保证发酵液中葡萄糖的相对稳定浓度，以及pH的稳定，使得菌体生长的各阶段都可以保持最佳生产状态，有效提高葡萄糖转化率和L‑丙氨酸的产率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及L-丙氨酸生产
，特别是涉及一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法。
技术介绍
丙氨酸是构成蛋白质的基本单位，是组成人体蛋白质的20种氨基酸之一。它的分子式是C3H7NO2，有α-丙氨酸和β-丙氨酸两种同分异构体。目前L-丙氨酸的发酵生产采用的是将微量无机盐类进行灭菌处理作为底物加入已经消毒灭菌好发酵培养基中。接入培养好的种子液进行发酵培养。葡萄糖作为底物全部或将其总量1/3消毒灭菌后，接入培养好的种子液进行发酵培养，培养过程不加入或加入剩余的总量2/3分为2-3次集中一次性补入。现有技术存在的技术缺陷：微量元素在培养基中的开始总量浓度较大，种子液移入后开始大量消耗，后期得不到必要的补充。葡萄糖在整个发酵过程中浓度不均一，消耗降至低点时，又一次性补入大量葡萄糖，浓度成波浪形变动，不利于菌体的生长代谢。糖高会产生酸类物质，如乳酸等，造成菌体不长，pH下降；糖低营养不足，造成菌体不长。菌体不长或生长缓慢打破L-丙氨酸正常的代谢途径，同时造成ph变化，会形成二碳化合物，转化为有机酸及酯等副产物。pH变化造成诱导L-丙氨酸的产生酶系发生诱导环境变化而停止诱导，或诱导发生偏移，会造成D-丙氨酸、羟赖氨酸、甘氨酸产生。发生以上情况从而使L-丙氨酸的纯度降低，消耗葡萄糖，降低了葡萄糖对L-丙氨酸的转化率，增加生产成本。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法。微量元素混合液的补料，避免了微量元素在培养基中消耗，后期得不到必要的补充的问题。通过本专利技术的补料方法，可以保证发酵液中葡萄糖的相对稳定浓度，以及pH的稳定，使得菌体生长的各阶段都可以保持最佳生产状态，有效提高葡萄糖转化率和L-丙氨酸的产率。本专利技术的一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法技术方案为，包括以下步骤：A.微量元素混合液补料，用纯化水将微量元素配制成微量元素混合液，按照110ml/min-170ml/min的补入速率补入发酵培养基中；B.pH在线监测以及葡萄糖补料，依次包括以下步骤：（1）发酵过程起始底糖30g/L，消毒灭菌后用氨水将pH调解值7.0，开始发酵后用氨水进行pH控制6.95-7.05；（2）当底糖降至10g/L时，流加补入葡萄糖，补料速率为30g/L.h，检测糖含量维持在6-8g/L之间，PH维持在6.85-6.95之间；（3）在当糖含量≥8g/L，减少流加补糖速率控制8g/L.h以下，同时将pH控制在6.95-7.00之间。（4）当糖含量≤6g/L时，加大流加补糖速率控制8g/L.h以上，同时将pH控制在6.80-6.85之间；（5）当检测OD值达到30时，将pH降到6.45-6.55进行L-丙氨酸的产生酶系诱导，糖含量维持2-3g/L之间，同时对L-丙氨酸进行杂质分析，根据杂质氨基酸在0.2%以上时将糖含量降至0.5-1.0g/L。（6）当菌体的比生长速率低于2g/L.h时停止补入葡萄糖，pH维持6.50-6.55直至将糖到0时，结束发酵。比生长速率μ:每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率。为表征微生物生长速率的一个参数，其大小为0.693除以倍增时间td(td--倍增时间，即为微生物细胞量变为原来二倍所需时间)。A中，补入微量元素混合液的开始时间点为开始进行种子液移入发酵培养基培养前的30min。A中，微量元素混合液温度控制在15-18℃。B中，步骤（1）中，pH采用DCS在线监测。B中，步骤（2）中，当底糖降至10g/L时，根据比生长速率u逐渐增大至0.4h-1时，加快补糖速率，比生长速率最大可达到0.7h-1以上。B中，步骤（3）中，每1h用采用生物传感自动分析仪快速检测糖含量。B中，步骤（6）中，结束发酵控制点接近0时立即放罐，时间不得超过15min，否则产生菌会利用产生的L-丙氨酸，而产生丙酮酸降低收率及产生杂酸。所述的一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法，采用大肠埃希氏菌CGMCC No.10628发酵生产L-丙氨酸。发酵培养基包括以下成分：磷酸氢二钠15.11g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸铵13.2g/L、硫酸镁0.246g/L、葡萄糖30g/L，其余为水；加入氨水调节pH，加入不超过发酵培养基总体积千分之二的消泡剂调节控制泡沫。 其中，氨水质量百分比浓度为23±2%，消泡剂为江苏赛欧信越消泡剂有限公司生产的生物发酵用消泡剂。微量元素混合液包括：2.4g/L六水三氯化铁、0.3g/L六水氯化钴、0.15g/L二水氯化铜、0.3g/L氯化锌、0.3g/L二水钼酸钠、0.075g/L硼酸、0.495g/L四水氯化锰，其余为水。本专利技术的有益效果为：微量元素混合液的补料，避免了微量元素在培养基中消耗，后期得不到必要的补充的问题。微量元素混合液不用进行消毒灭菌，直接无菌过滤加入。可防止高温灭菌时微量元素的还原反应，本方法直接纯化水配制过滤使用，不会对微量元素造成破坏。葡萄糖和pH的实时监控和流加调节，避免了葡萄糖在整个发酵过程中浓度不均一，以及一次性补入大量葡萄糖，不利于菌体的生长代谢的问题。此外糖高会产生酸类物质，如乳酸等，造成菌体不长，pH下降；糖低营养不足，造成菌体不长。菌体不长或生长缓慢打破L-丙氨酸正常的代谢途径，同时造成pH变化，会形成二碳化合物，转化为有机酸及酯等副产物。pH变化造成诱导L-丙氨酸的产生酶系发生诱导环境变化而停止诱导，或诱导发生偏移，会造成D-丙氨酸、羟赖氨酸、甘氨酸产生。发生以上情况从而使L-丙氨酸的纯度降低，消耗葡萄糖，降低了葡萄糖对L-丙氨酸的转化率，增加生产成本。通过本专利技术的补料方法，可以保证发酵液中葡萄糖的相对稳定浓度，以及pH的稳定，使得菌体生长的各阶段都可以保持最佳生产状态，有效提高葡萄糖转化率和L-丙氨酸的产率。本补料方法的使用，放罐单位可以达到150g/L以上，葡萄糖转化率在95.5%以上，生产成本较目前的先进水平降低18%左右。所得L-丙氨酸产品纯度高第三方检测99.5%以上（山东启标检测），99.9%以上（上海勤路检测）。附图说明：图1所示为实施例1生产的L-丙氨酸高效液相色谱图；图2所示为实施例2生产的L-丙氨酸高效液相色谱图；图3所示为实施例3生产的L-丙氨酸高效液相色谱图。具体实施方式：为了更好地理解本专利技术，下面用具体实例来详细说明本专利技术的技术方案，但是本专利技术并不局限于此。实施例1所述的一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法，采用大肠埃希氏菌CGMCC No.10628发酵生产L-丙氨酸。所述的大肠埃希氏菌CGMCC No.10628已于 2015 年 3 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCCNo.10628。该菌株已经于2015年7月15日在公布号 CN 104774790 A的专利申请中公开。发酵培养基包括以下成分：磷酸氢二钠15.11g/L、磷酸氢二钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物发酵生产提高L‑丙氨酸产量的补料控制方法，其特征在于，包括以下步骤：A.微量元素混合液补料，用纯化水将微量元素配制成微量元素混合液，按照110ml/min‑170ml/min的补入速率补入发酵培养基中；B.pH在线监测以及葡萄糖补料，依次包括以下步骤：（1）发酵过程起始底糖30g/L，消毒灭菌后用氨水将pH调解值7.0，开始发酵后用氨水进行pH控制6.95‑7.05；（2）当底糖降至10g/L时，流加补入葡萄糖，补料速率为30g/L.h，检测糖含量维持在6‑8g/L之间，PH维持在6.85‑6.95之间；（3）在当糖含量≥8g/L，减少流加补糖速率控制8g/L.h以下，同时将pH控制在6.95‑7.00之间；（4）当糖含量≤6g/L时，加大流加补糖速率控制8g/L.h以上，同时将pH控制在6.80‑6.85之间；（5）当检测OD值达到30时，将pH降到6.45‑6.55进行L‑丙氨酸的产生酶系诱导，糖含量维持2‑3g/L之间，同时对L‑丙氨酸进行杂质分析，根据杂质氨基酸在0.2%以上时将糖含量降至0.5‑1.0g/L；（6）当菌体的比生长速率低于2g/L.h时，停止补入葡萄糖，pH维持6.50‑6.55直至将糖到0时，结束发酵。...

【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法，其特征在于，包括以下步骤：A.微量元素混合液补料，用纯化水将微量元素配制成微量元素混合液，按照110ml/min-170ml/min的补入速率补入发酵培养基中；B.pH在线监测以及葡萄糖补料，依次包括以下步骤：（1）发酵过程起始底糖30g/L，消毒灭菌后用氨水将pH调解值7.0，开始发酵后用氨水进行pH控制6.95-7.05；（2）当底糖降至10g/L时，流加补入葡萄糖，补料速率为30g/L.h，检测糖含量维持在6-8g/L之间，PH维持在6.85-6.95之间；（3）在当糖含量≥8g/L，减少流加补糖速率控制8g/L.h以下，同时将pH控制在6.95-7.00之间；（4）当糖含量≤6g/L时，加大流加补糖速率控制8g/L.h以上，同时将pH控制在6.80-6.85之间；（5）当检测OD值达到30时，将pH降到6.45-6.55进行L-丙氨酸的产生酶系诱导，糖含量维持2-3g/L之间，同时对L-丙氨酸进行杂质分析，根据杂质氨基酸在0.2%以上时将糖含量降至0.5-1.0g/L；（6）当菌体的比生长速率低于2g/L.h时，停止补入葡萄糖，pH维持6.50-6.55直至将糖到0时，结束发酵。2.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法，其特征在于，A中，补入微量元素混合液的开始时间点为开始进行种子液移入发酵培养基培养前的30min。3.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产提高L-丙氨酸产量的补料控制方法，其特征在于，A中，微量元素混合液温度控制在15-18℃。4.根据权利要求1所述的一种微生物发酵生产提高L-...

【专利技术属性】
技术研发人员：王京光，魏哲，王长海，李晓芸，陈忠，
申请(专利权)人：山东金朗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37