一种利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法，是将高产纤维素酶的丝状真菌作为生产菌株，在以废弃纤维素和廉价天然原料为主要成分的发酵培养基中发酵，在发酵过程中以恒定流加速率或者阶段性改变流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液诱导产酶和补充养分，也可以依据在发酵过程中取样测定的还原糖浓度或者溶氧的变化来调整制浆废液的流加速度，制得含纤维素酶的发酵液。本发明专利技术方法操作简便，生产成本低，减少了亚硫酸铵法制浆时产生的棕黑色废液造成的环境污染，并可显著提高纤维素酶的发酵水平，在工业生产中有望得到广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及发酵工程领域，具体涉及一种以亚硫酸铵法制浆废液作为补料物实施补料发酵生产纤维素酶的方法。
技术介绍
纤维素酶是酶制剂中的一个重要品种，广泛应用于印染、饲料、酿造等行业，特别在纤维素乙醇的生产过程中发挥关键作用。当前市场对纤维素酶需求量逐年迅速增加，诺维信、杰能科等国际大型酶制剂生产企业也将研发重点放在提高纤维素酶的效率和生产技术上，可以预测未来纤维素酶的市场前景非常广阔。液体深层发酵是当前工业上生产纤维素酶的主要方式。通常情况下，液体培养基中基质浓度和纤维素酶产量呈正相关，但纤维素、麸皮等基质的吸水性较强，在含量过高时会影响溶氧和水活度等条件，从而影响到纤维素酶的生产，所以培养基中的基质浓度一般都低于10％。研究表明，补料的发酵方式可以有效地提高纤维素酶的产量。饶庆隆在发酵过程中每24h补加2g/L的纸浆，滤纸酶活提高了80％(南京林业大学学报：自然科学版，饶庆隆，2008,32(3)：57-60)。LijuanMa则通过物料守恒策略补加微晶纤维素使里氏木霉(T.reesei)的滤纸酶活提高了82.13％，达到19.07IU/mL(JournalofBiotechnology，LijuanMa，2013,166(4)：192-197)。从已经报道的工作看，纤维素酶发酵生产时补料物均为纯纤维素或富含纤维素的材料，这些物质多难溶于水，价格较高且吸水性非常强，只能采用少量多次补加的补料策略，未能实现连续流加补料发酵的生产工艺，操作复杂并存在一定染菌的风险。我国许多造纸企业是利用麦草、稻草等农业废弃秸秆作为原料采用亚硫酸铵法进行制浆，在蒸煮过程中产生的棕黑色废液(以下简称制浆废液)大多直接排放，造成了环境污染，而这种制浆废液中含有一定量的半纤维素、葡聚糖和铵盐，因为半纤维素、葡聚糖等能够诱导分泌纤维素酶，铵盐可为微生物生长提供氮源，因此其有望作为纤维素酶发酵过程中的补料物，但检索发现，目前为止工业上还没有流加制浆废液补料发酵生产纤维素酶的实例。
技术实现思路
针对现有技术中纤维素类材料作为补料物时成本高、难连续流加的缺陷，本专利技术要解决的问题是提供一种以亚硫酸铵法制浆废液作为补料物实施补料发酵生产纤维素酶的方法。该方法培养基成本低、所产纤维素酶活力高，同时解决了制浆废液造成的环境污染问题。本专利技术所述利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法，是将高产纤维素酶的丝状真菌做为生产菌株，按体积百分比2～15％的接种量将种子液接入发酵培养基，以温度为25～35℃，搅拌转速为150～400r/min，通风比为0.4～1.2vvm的条件进行发酵培养，pH和溶解氧由发酵罐控制单元测定并控制，在发酵过程中以恒定流加速率或者阶段性改变流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液诱导产酶和补充养分，其中在发酵过程中设定间隔一定时间取样，测定酶活力、还原糖浓度并依据在发酵过程中取样测定的还原糖浓度来调整废液的流加速度，培养120～180h后当滤纸酶活不再增加或呈现下降趋势时发酵结束放罐，即获得含纤维素酶的发酵液；其特征在于：所述高产纤维素酶的丝状真菌是以草酸青霉(Penicillium.oxalicum)RE-10或者里氏木霉(Trichodermareesie)SN1为代表的纤维素酶生产菌株；所述发酵培养基的组成是以废弃纤维素木糖渣和廉价天然原料麸皮、豆饼粉为主要组成成分，其配方为：木糖渣18～22g/L，微晶纤维素5～7g/L，麸皮45～50g/L，豆饼粉8～12g/L，硫酸铵2～4g/L，硝酸钠2～3g/L，尿素0.5～1g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硫酸镁0.4～0.6g/L，加蒸馏水定容到1L；所述造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液是指造纸厂采用亚硫酸铵法进行制浆时，在从植物纤维原料分离出纤维的蒸煮过程中产生的棕黑色液体，其组分中至少含有80～120g/L的半纤维素、30～50g/L葡聚糖和20～40g/L的单糖；所述以恒定流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的棕黑色废液的流加速率是0.1～5mL/L/h，流加的起始时间为发酵前期0～120h；所述阶段性改变流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的棕黑色废液的方法是：接种之后，在前10h以0.1mL/L/h速率流加废液，随后每10h将流加的速率提高一倍，在50h后黑液所述废液的流加速率达到3.2mL/L/h，维持3.2mL/L/h的流加速率不变，持续流加废液补料至100h；所述依据在发酵过程中取样测定的还原糖浓度来调整废液的流加速度中，当测得测定的还原糖浓度应控制在低于10mg/L以下时，维持原废液的流加速率；当测得的还原糖浓度在10mg/L以上时，减慢原废液的流加速率，使再次取样测定的还原糖浓度在10mg/L以内。上述利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法中：所述高产纤维素酶的丝状真菌优选是草酸青霉(P.oxalicum)Re-10或者里氏木霉(T.reesei)SN1。上述利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法中：所述以恒定流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液的流加速率优选是1mL/L/h。上述利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法中，利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的条件优选是：种子液接入发酵培养基接种之后，发酵温度控制在30℃，通风比0～12h控制在0.5，12～24h后控制在0.75，24～36h后控制在1，搅拌转速优选控制在300r/min。本专利技术公开的利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法，利用制浆废液中含有的半纤维素、葡聚糖诱导微生物分泌纤维素酶，能够进行连续性的补料操作。通过优化补料工艺，得到了较高的纤维素酶活力及得率，降低了生产成本，并且解决了制浆废液造成环境污染的难题，有望在工业生产中得到广泛应用。附图说明图1：亚硫酸铵法制浆废液中各种单糖及多糖的浓度。图2：利用草酸青霉以0.5mL/L/h恒速流加制浆废液进行补料发酵生产纤维素酶过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。图3：利用草酸青霉以1mL/L/h恒速流加制浆废液进行补料发酵生产纤维素酶过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。图4：利用草酸青霉变速流加制浆废液补料发酵生产纤维素酶过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。图5：利用里氏木霉分批发酵生产纤维素酶过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。图6：利用里氏木霉以溶氧反馈控制流加制浆废液补料发酵生产纤维素酶过程中产酶、溶氧及pH的变化曲线。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术保护内容作进一步阐述。实施例中所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制本专利技术权利要求所述的保护范围。实施例1：利用草酸青霉以0.5mL/L/h速率恒速流加制浆废液进行补料发酵生产纤维素酶采用的生产菌株草酸青霉(Penicilliumoxalicum)可以为经过诱变选育或基因改造过的高产菌株。如P.oxalicumA10为经过多轮诱变筛选后又经亚铵废液驯化过的高产菌株P.oxalicumRe-10，该菌株是以野生菌株P.oxalicum114-2为出发菌株，依次进行用gpdA启动子过表达clrB、敲除本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法，是将高产纤维素酶的丝状真菌作为生产菌株，按体积百分比2～10％的接种量将种子液接入发酵培养基，以温度为25～35℃，搅拌转速为150～400r/min，通风比为0.4～1.2vvm的条件进行发酵培养，pH和溶解氧由发酵罐控制单元测定并控制，在发酵过程中，以恒定流加速率或者阶段性改变流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液诱导产酶和补充养分，其中在发酵过程中设定间隔时间取样，测定酶活力、还原糖浓度并依据取样测定的还原糖浓度来调整废液的流加速度，培养120～180h后当滤纸酶活不再增加或呈现下降趋势时发酵结束放罐，即获得含纤维素酶的发酵液；其特征在于：所述高产纤维素酶的丝状真菌是以草酸青霉(Penicillium.oxalicum)RE‑10或者里氏木霉(Trichoderma reesie)SN1为代表的纤维素酶生产菌株；所述发酵培养基是以废弃纤维素木糖渣、麸皮和豆饼粉为主要组成成分，其配方为：木糖渣18～22g/L，微晶纤维素5～7g/L，麸皮45～50g/L，豆饼粉8～12g/L，硫酸铵2～4g/L，硝酸钠2～3g/L，尿素0.5～1g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硫酸镁0.4～0.6g/L，加蒸馏水定容到1L；所述造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液是指造纸厂采用亚硫酸铵法进行制浆时，在从植物纤维原料分离出纤维的蒸煮过程中产生的棕黑色液体，其组分中至少含有80～120g/L的半纤维素、30～50g/L葡聚糖和20～40g/L的单糖；所述以恒定流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液的流加速率是0.1～5mL/L/h，流加的起始时间为发酵前期0～120h；所述阶段性改变流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液的方法是：接种之后，在前10h以0.1mL/L/h速率流加废液，随后每10h将流加的速率提高一倍，在50h后所述废液的流加速率达到3.2mL/L/h，维持3.2mL/L/h的流加速率不变，持续流加废液补料至100h；所述依据取样测定的还原糖浓度来调整废液的流加速度中，当测得的还原糖浓度在10mg/L以下时，维持原废液的流加速率；当测得的还原糖浓度在10mg/L以上时，减慢原废液的流加速率，使再次取样测定的还原糖浓度在10mg/L以内。...

【技术特征摘要】
1.一种利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法，是将高产纤维素酶的丝状真菌作为生产菌株，按体积百分比2～10％的接种量将种子液接入发酵培养基，以温度为25～35℃，搅拌转速为150～400r/min，通风比为0.4～1.2vvm的条件进行发酵培养，pH和溶解氧由发酵罐控制单元测定并控制，在发酵过程中，以恒定流加速率或者阶段性改变流加速率向发酵罐中补加造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液诱导产酶和补充养分，其中在发酵过程中设定间隔时间取样，测定酶活力、还原糖浓度并依据取样测定的还原糖浓度来调整废液的流加速度，培养120～180h后当滤纸酶活不再增加或呈现下降趋势时发酵结束放罐，即获得含纤维素酶的发酵液；其特征在于：所述高产纤维素酶的丝状真菌是以草酸青霉(Penicillium.oxalicum)RE-10或者里氏木霉(Trichodermareesie)SN1为代表的纤维素酶生产菌株；所述发酵培养基是以废弃纤维素木糖渣、麸皮和豆饼粉为主要组成成分，其配方为：木糖渣18～22g/L，微晶纤维素5～7g/L，麸皮45～50g/L，豆饼粉8～12g/L，硫酸铵2～4g/L，硝酸钠2～3g/L，尿素0.5～1g/L，磷酸二氢钾2～4g/L，硫酸镁0.4～0.6g/L，加蒸馏水定容到1L；所述造纸厂亚硫酸铵法制浆时产生的废液是指造纸厂采用亚硫酸铵法进行制浆时，在从植物纤维原料分离出纤维的蒸煮过程中产生的棕黑色液体，其组分中至少含有80～120g/L的半纤维素、30～50g/L葡聚糖和20～40g\...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲音波，韩小龙，李雪芝，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37