本发明专利技术提供了一种具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌，其为基因组中整合有ACC脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌SL-13。本发明专利技术获得的具有解盐促生作用和生物防治功能的双效菌株，在盐浓度为0.7%的胁迫条件下，进行重组菌的功能分析。用重组菌发酵液浸泡棉花种子进行发芽实验，结果表明，用重组菌处理后的棉种发芽率比对照提高了10.1%；对棉苗立枯病的抑菌实验表明，与野生枯草芽孢杆菌SL-13相比，重组菌仍具有较强的对棉苗立枯病的防治效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及生物防治领域，具体地说，涉及一种具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌。
技术介绍
近年来，由新疆地区长期滴灌而产生的次生盐溃化现象越来越严重。盐溃化土壤面积已占耕地面积的约30%，严重制约和影响了该地区棉花的产量和棉花产业的可持续发展。因棉种质量，环境条件和管理措施不当造成的棉花苗期病害直接威胁棉花的产量。现有应对次生盐溃化土壤和棉花苗期病害的措施具有种种弊端，而且收效不甚显著。近年发展起来的生物学防治方法，因其效果较显著和对环境友好等优点逐渐受到人们的重视。例如，从植物根围促生菌(Plantgrowth-promoting rhizobacteria,简称PGPR)与植物互作的角度入手，分离出能够显著提高棉花在盐胁迫下的发芽率，促进棉花根长和干重的增加，分泌植物生长素和溶磷等作用的PGPR解盐促生菌植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)RS-2、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) RS-5、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)RS-35和具有生物防治功能的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) SL-13。PGPR在促进植物生长、提高植物抗逆性和富集重金属离子改良环境等方面具有重要作用。其中一类具有ACC脱氨酶活性的PGPR菌在降低植物体内乙烯的含量，减缓植物衰老，提高植物抗逆性等方面发挥着关键作用。以上筛选到的三株PGPR菌植生拉乌尔菌RS-2、产酸克雷伯氏菌RS-5和阴沟肠杆菌RS-35均具有ACC脱氨酶活性，能很好的缓解次生盐溃化对棉花种子发芽和苗期发育的影响。筛选到的枯草芽孢杆菌SL-13对棉花苗期病害具有一定的防治作用。前期的研究中，通过组合这两类菌制备了既具有解盐促生功能，又具有苗期生防作用的生物菌剂，在田 间试验也取得了较好的效果，但需要多批次大规模的菌体培养，费时费力，不利于节约成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌，其为基因组中整合有ACC脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌SL-13。本专利技术还提供构建上述重组菌的方法将来自产酸克雷伯氏菌RS-5中的ACC脱氨酶基因构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，如PHCMC04上，并将其转入枯草芽孢杆菌SL-13中。例如，可以通过电击法将构建好的表达载体转入枯草芽孢杆菌SL-13的感受态细胞中。本专利技术还提供所述重组枯草芽孢杆菌在促进植物生长、提高植物抗逆性以及改良根系周围土壤环境方面的应用。例如，所述植物为棉花等。本专利技术还提供一种复合微生物菌剂，其有效成分为所述具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌，以及其它不发生相互拮抗作用的促生菌或具有生物防治功能的微生物。本专利技术进一步提供一种微生物复合肥，包括上述复合微生物菌剂和氮磷钾肥。任选其它可在作物肥料中使用的添加剂。本专利技术获得的具有解盐促生作用和生物防治功能的双效菌株，在盐浓度为0. 7%的胁迫条件下，进行重组菌的功能分析。用重组菌发酵液浸泡棉花种子进行发芽实验，结果表明，用重组菌处理后的棉种发芽率比对照提高了 10. 1%;对棉苗立枯病的抑菌实验表明，与野生枯草芽孢杆菌SL-13相比，重组菌仍具有较强的对棉苗立枯病的防治效果。附图说明图1为本专利技术ACC脱氨酶基因PCR电泳图；其中，M:DL2000DNAmarker ；1和2:PCR扩增产物。(DNA Marker 由上至下依次为2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)·图2为本专利技术穿梭质粒pHCMC04电泳图；其中，M DNA marker I kb ；1 :质粒PHCMC04 ；2 =SmaI 单酶切后的 pHCMC04 质粒。(DNAMarker 由上至下依次为IOOOObp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)图3为本专利技术双酶切ACC脱氨酶基因和质粒pHCMC04的电泳图；其中，M=DNAmarker Ikb ；1 :SpeI和SmaI双酶切后ACC脱氨酶基因；2 :SpeI和SmaI双酶切后的PHCMC04质粒。(DNA Marker 由上至下依次为10000bp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 30OObp,2000bp, IOOObp)图4为本专利技术ACC脱氨酶基因穿梭表达载体构建过程示意图。图5为本专利技术重组质粒的鉴定PCR电泳图；其中，M DNA markerDL2000 ；1 :以pMD18_Koacds质粒为模板；2 :以菌落为模板。(DNAMarker由上至下依次为2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,IOObp)图6为本专利技术重组质粒双酶切电泳图；其中，M DNA Marker Ikb ；1 =SpeI和SmaI双酶切后的重组菌质粒。(DNAMarker由上至下依次为IOOOObp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)图7为本专利技术电转化后菌落PCR产物电泳图；其中，M =DNAmarker DL2000 ；CK :阳性对照；1_10 :以菌落为模板。(DNA Marker由上至下依次为2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp,250bp,IOObp)图8为本专利技术电转化后重组子双酶切电泳图；其中，M =DNAmarker Ikb ；1 :重组质粒；2 =SacI和SphI双酶切后的质粒。(DNAMarker的大小由上至下依次为IOOOObp, 8000bp, 7000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2000bp, IOOObp)图9为本专利技术重组枯草芽孢杆菌SL-13对立枯丝核病菌的抑菌效果；其中，CK LB培养基对照；1 RS-5菌液；2 :重组枯草芽孢杆菌SL-13 ；3 :野生枯草芽孢杆菌SL-13。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989)。所用原料均为市售商品。实施例1具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌SL-13的构建1.构建ACC脱氨酶基因穿梭表达载体1.1ACC脱氨酶基因的获得通过在NCBI网站上搜索已经报道的ACC脱氨酶基因序列，进行序列比对后，在保守序列处设计引物，以产酸克雷伯氏菌RS-5的基因组DNA为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序。序列已提交GenBank，登录号为FJ357241。1. 2ACC脱氨酶基因及其序列验证扩增产物ACC脱氨酶基因大小为1017bp。从琼脂糖凝胶电泳结果可以看出，扩增片段大小在IOOObp左右，与预期结果相符(图1)。1. 3穿梭质粒pHCMC04的提取与酶切验证提取本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，其为基因组中整合有ACC脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌SL?13。
【技术特征摘要】
1.具有解盐促生与生物防治功能的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，其为基因组中整合有ACC脱氨酶基因的枯草芽孢杆菌SL-13。2.构建权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，将来自产酸克雷伯氏菌RS-5中的ACC脱氨酶基因构建到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PHCMC04上，并将其转入枯草芽孢杆菌SL-13中。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用电击法将构建好的表达载体转入枯草芽孢杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：王艳，郑嫣然，余宏燕，
申请(专利权)人：蚌埠丰原涂山制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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